论文摘要
慢性髓细胞白血病（Chronic myeloid leukemia, CML）具有特征性的BCR-ABL融合基因。较多的研究已证明,BCR-ABL融合基因及其表达蛋白p210bcr-abl在CML的致病中起关键作用,因此,BCR-ABL融合蛋白的检测对CML的研究和诊断具有重要意义。p210bcr-abl融合区可作为肿瘤特异性标志物,至今为止,还未发现针对p210bcr-abl融合区单克隆抗体的报道,这已经成为CML基础和临床研究工作的瓶颈之一。缺少针对p210bcr-abl融合区单克隆抗体的真正原因,究竟是由于p210bcr-abl融合区没有BCR（B细胞受体）识别表位,还是因为p210bcr-abl融合区单克隆抗体制备的特殊性所致,这引起我们的兴趣。本研究的目的是研制p210bcr-abl融合蛋白的单克隆抗体并试图筛选到针对融合区的单克隆抗体,为本实验室CML的研究提供一种方便、有效的工具。1.慢性髓细胞白血病BCR-ABL融合蛋白融合区B细胞表位预测我们选择了BCR-ABL融合基因b3a2融合位点周围151个氨基酸序列,采用EMBOSS软件及DNAstar软件,结合Hopp&Woods亲水性参数、Janin可及性参数、极性参数、柔韧性参数及二级结构方案,对慢性髓细胞白血病BCR-ABL融合蛋白融合区的B细胞表位进行了预测。通过多个参数预测结果表明,p210bcr-abl融合区可能存在B细胞表位,该研究对应用合成肽抗原制备融合区单克隆抗体具有重要的指导意义。2. BCR-ABL融合基因片段的克隆、表达与表达蛋白的纯化和免疫原性分析以带有BCR-ABL全长cDNA序列的重组质粒MIG210为模板,采用PCR方法扩增包含BCR-ABL （b3a2）融合位点周围约470bp的基因片段,将其定向克隆到pQE-31载体内,转化大肠杆菌M15菌株,以IPTG诱导表达含有6×His-tag的融合蛋白p18bcr-abl并对其进行纯化,免疫BALB/c小鼠。间接ELISA证实,免疫小鼠血清内能够检测到针对p210bcr-abl的特异性抗体。说明该表达产物具有p210bcr-abl融合蛋白的特异抗原性,为进一步的实验研究奠定了基础。3.抗BCR-ABL融合蛋白单克隆抗体的研制及其特性用纯化的p18bcr-abl融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用间接ELISA试验方法反复筛选阳性克隆,并经有限稀释法3次亚克隆,结果获得了6株特异性分泌抗BCR-ABL融合蛋白的阳性杂交瘤细胞株。Western-blotting方法鉴定结果表明,这些单抗可识别慢性髓细胞白血病阳性细胞株K562蛋白提取液的210kD的BCR-ABL蛋白和145kD的c-abl蛋白,表明单抗特异性识别BCR-ABL蛋白abl端。我们将这六株杂交瘤细胞分别命名为抗abl-1A4、抗abl-2C5、抗abl-2H1、抗abl-4G2、抗abl-5F6、抗abl-5G4。这6株单抗的腹水ELISA效价为1:103-1:106,细胞上清为1:160 -1:10240。杂交瘤细胞在液氮中冻存8个月后复苏出来仍能稳定地分泌抗abl特异性抗体。本试验中,虽然我们未能得到针对融合区的单抗,但所获得的抗BCR-ABL蛋白abl端的单抗与商品化的抗c-abl（24-11）单抗具有同样的使用效果。这些单抗的研制为本实验室慢性髓细胞白血病的研究提供了方便、经济的试验工具。