鸭肠炎病毒ul27基因特征及其编码蛋白部分抗原表位优势区的鉴定

论文摘要

鸭病毒肠炎（duck viral enteritis,DVE）,又名鸭瘟（duck plague,DP）,是由鸭肠炎病毒（duckEnteritis virus,DEV）引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。其特征是流行广泛,传播迅速,发病率和死亡率高,给养鸭业造成巨大的经济损失。DEV具有疱疹病毒典型的形态和结构,因此划分为疱疹病毒科,其亚科、属、种分类地位尚未确定。大多数疱疹病毒有12种糖蛋白,gB是最保守的结构糖蛋白之一,在多数疱疹病毒中gB同源物由ul27基因编码。该糖蛋白是病毒复制所必须的,参与病毒吸附、融合穿入及病毒在细胞间的传播,能刺激机体产生中和抗体,介导细胞免疫,是重组疫苗和亚单位疫苗的候选抗原,也是哺乳动物疱疹病毒血清学诊断方法的候选抗原。目前还没有关于DEVul27基因及其编码产物的深入研究。本试验以DEV ul27基因为研究对象,采用PCR技术克隆了DEV C-KCE株ul27基因,并从该基因与其他疱疹病毒的同源性、编码蛋白的结构及抗原性等方面进行了较为详尽的生物信息学分析,在此基础上利用原核表达载体pET-32a在Rosetta（DE3）PlysS宿主菌中分别表达了该基因9个抗原片段,以鸭肠炎病毒高免血清为第一抗体,通过Western blot确定了UL27蛋白的B细胞线性抗原表位优势区,以制备的鼠源抗原肽特异性抗血清进行蚀斑减数试验确定了中和抗原表位的优势区,利用体外淋巴细胞转化试验揭示了外周血抗原特异性T淋巴细胞对DEV的回忆应答规律,通过统计分析初步确定了T淋巴细胞的抗原表位。结果表明:DEV C-KCE株ul27基因完整ORF为3003bp,编码1000个氨基酸,同源性分析表明该基因为α疱疹病毒gB同源物,其遗传进化分析提示DEV与α疱疹病毒马立克氏病毒属亲缘关系最近;ul27基因编码产物具有典型跨膜蛋白结构,推测其信号肽序列位于N端前105个氨基酸以内,胞外区从信号肽裂解位点至832位氨基酸,跨膜区为833～883位氨基酸,胞内区为884～1000位氨基酸;蛋白胞外区存在8个潜在的N糖基化位点,10个保守的半胱氨酸,具有潜在的翻译修饰后的酶解位点,HSPGs结合位点、PACS-1结合基序,符合α疱疹病毒gB的结构特征和功能特征;Western blot结果表明UL27-2、UL27-5、UL27-7、UL27-9抗原肽存在B细胞线性表位,其中UL27-5抗原性最强,UL27-7刺激机体产生的抗体持续时间最长;蚀斑减数试验确定UL27-5、UL27-6、UL27-7、UL7-8、UL27-9、UL27-10抗原肽的抗血清具有中和活性,其中UL27-7、UL27-8是中和表位优势区;体外淋巴细胞转化试验表明,9段抗原肽及其不同组合均具有诱导外周血淋巴细胞发生转化的能力,外周血抗原特异性淋巴细胞在回忆应答中对DEV及UL27抗原肽的反应能力呈现缓慢增强,达到高峰后又快速回落的趋势。经统计分析初步确定DEV UL27 T细胞表位优势区是UL27-6,候选优势区是UL27-4、UL27-10。本研究为明确DEV的分类地位,阐明DEV gB的功能,了解其在机体免疫过程中发挥的作用及其在实践中应用的可能性提供了理论依据和物质基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 鸭病毒肠炎研究概况
• 1.1.1 临床症状
• 1.1.2 病理剖检变化
• 1.1.3 流行病学
• 1.1.4 诊断
• 1.1.5 鸭病毒性肠炎的防制
• 1.1.6 免疫失败及防治对策
• 1.2.鸭肠炎病毒研究概况
• 1.2.1 鸭肠炎病毒的生物学特性
• 1.2.2 鸭肠炎病毒的分子生物学特性
• 1.3 疱疹病毒概述
• 1.3.1 疱疹病毒的分类
• 1.3.2 疱疹病毒的形态结构
• 1.3.3 疱疹病毒的基因组结构
• 1.3.4 疱疹病毒的转录与调控
• 1.3.5 疱疹病毒编码的蛋白
• 1.3.6 疱疹病毒的复制
• 1.4 疱疹病毒gB的研究进展
• 1.4.1 编码gB的基因
• 1.4.2 gB的结构特征
• 1.4.3 gB的转运与加工
• 1.4.4 gB的功能
• 1.4.5 gB的应用
• 1.5 抗原表位的研究方法
• 1.5.1 B细胞表位的研究方法
• 1.5.2 T细胞表位的研究方法
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒、鸡胚、试验动物
• 2.1.2 载体与感受态细胞
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 软件及网络资源
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 鸭瘟病毒的增殖与DNA的提取
• 2.2.2 DEV ul27基因的克隆与序列分析
• 2.2.3 ul27基因编码产物的结构预测及抗原性分析
• 2.2.4 ul27基因的分段表达
• 2.2.5 目的蛋白的纯化与浓度测定
• 2.2.6 UL27蛋白B细胞抗原表位优势区的鉴定
• 2.2.7 UL27蛋白中和抗原表位优势区的鉴定
• 2.2.8 UL27蛋白刺激外周血淋巴细胞转化试验
• 3 结果
• 3.1 DEV ul27基因的克隆与测序
• 3.1.1 DEV ul27基因的克隆
• 3.1.2 DEV ul27clone片断的序列测定
• 3.2 DEV ul27基因及其编码产物的生物信息学分析
• 3.2.1 DEV ul27基因ORF预测
• 3.2.2 DEV ul27基因核苷酸的同源性分析
• 3.2.3 DEV ul27基因氨基酸的同源性分析
• 3.2.4 DEV UL27蛋白的结构预测分析
• 3.2.5 DEV UL27蛋白功能性基序预测
• 3.2.6 DEV UL27蛋白的抗原性分析
• 3.3 DEV UL27蛋白的分段表达、纯化及抗血清的制备
• 3.3.1 DEV ul27 2～10基因片断的克隆
• 3.3.2 DEV ul27 2～10基因片断重组原核表达载体的构建及鉴定
• 3.3.3 UL27-2～10的诱导表达
• 3.3.4 UL27-2～10重组融合蛋白的纯化
• 3.3.5 UL27-2～10重组融合蛋白的浓度测定
• 3.4 DEV UL27蛋白B细胞线性抗原表位优势区的鉴定
• 3.4.1 UL27-2～10重组蛋白Western blot结果
• 3.4.2 UL27蛋白线性中和抗原表位优势区的鉴定
• 3.5 UL27蛋白刺激机体细胞免疫应答的研究
• 3.5.1 淋巴细胞体外转化试验条件确定
• 3.5.2 不同抗原肽刺激淋巴细胞转化试验
• 4 讨论
• 4.1 DEV ul27基因及其编码产物的生物信息学分析
• 4.1.1 从DEV ul27基因同源性角度分析DEV的分类地位
• 4.1.2 DEV UL27蛋白与疱疹病毒gB的关系
• 4.2 DEV ul27基因分段表达的策略及分段表达
• 4.2.1 分段表达策略
• 4.2.2 原核表达载体选择的依据
• 4.3 DEV UL27蛋白的B细胞抗原表位优势区的确定
• 4.3.1 DEV UL27蛋白B细胞线性抗原表位优势区的确定
• 4.3.2 DEV UL27蛋白B细胞中和抗原表位优势区的确定
• 4.3.3 DEV UL27蛋白B细胞线性抗原表位与中和表位的关系
• 4.3.4 DEV UL27蛋白B细胞抗原表位的应用前景
• 4.4 DEV UL27蛋白T细胞抗原表位优势区的确定
• 4.4.1 DEV感染与DEV免疫
• 4.4.2 DEV UL27蛋白诱导淋巴细胞转化的规律
• 4.4.3 免疫组与非免疫组淋巴细胞转化能力的关系
• 4.4.4 DEV UL27蛋白T细胞表位优势区的初步确定
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的学术论文