玉米萎蔫病菌抗体制备及微流控芯片免疫检测方法研究

论文摘要

为了制备玉米细菌性萎蔫病菌的多克隆抗体并建立ELISA检测方法,以玉米细菌性萎蔫病菌（27822,ATCC）为免疫原,通过免疫兔子,获得多抗血清并进一步纯化。通过比较传统的碳酸缓冲液（CBS）4℃过夜包被法与乙醇加固包被法,发现乙醇有明显的提高检测灵敏度的作用。经过优化,抗血清的最佳工作浓度为1μg/mL,碱性磷酸酶标记的二抗稀释为1：2000倍使用时效果最佳。利用11种玉米上常见病害细菌和Clavibacter michiganense种中的亚种进行交叉反应实验,发现只与马铃薯环腐病菌有弱交叉反应。将伴有玉米种子提取物的玉米萎蔫病菌作为样品,利用上述优化的反应条件进行检测,检测限为5×106cfu／mg。报道了一种新型的以NCM为固相免疫反应载体的微流控芯片酶联免疫分析系统,微流控芯片装置包括控制系统、气泵、芯片和控制软件,芯片由上下2个片基（底片和盖片）和中间的一层薄膜组成,盖片基上粘贴各种储液池。微阀是通过气源压力带动聚苯乙烯薄膜产生形变来控制开关。一系列连续开启、闭合的微阀即形成微泵,液体在微泵的驱动下向指定的方向移动。利用激光切割技术成功制备了醋酸纤维素膜条（NCM）用于芯片反应通道中的固相免疫反应载体,膜片与膜片之间有塑料条相隔,避免了样品扩散和交叉感染。JAVA环境下开发的控制软件运行效果良好。微流控芯片酶联免疫检测系统运行稳定、自动化程度高,可实现快速、准确和高效检测,有望在实践中得到进一步应用。基于该系统,通过对样品点样量、抗体工作浓度和检测灵敏度的确定,建立了玉米细菌性萎蔫病菌微流控芯片酶联免疫分析检测方法。样品最佳点样量为5μL／样品,抗体最佳工作浓度为1μg/mL。与通常的微孔板ELISA相比,样品和试剂用量均显著降低（自100μL降为4-5μL／样品）,检测时间从24h减少到2.5h内完成,而检测灵敏度保持一致。该方法可用于对玉米细菌性萎蔫病菌的实际样品检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 玉米萎蔫病菌多抗制备和ELISA方法建立
• 第1章 前言
• 1.1 玉米萎蔫病研究进展
• 1.1.1 发生与危害情况
• 1.1.2 症状
• 1.1.3 病原菌分类
• 1.1.4 病原菌形态和生理生化特征
• 1.1.5 宿主范围
• 1.1.6 传播途径
• 1.1.7 防治
• 1.2 玉米细菌萎蔫病菌检验技术研究进展
• 1.2.1 分离培养检测
• 1.2.2 血清学检测
• 1.2.3 分子生物学检测
• 1.3 本研究工作的主要内容及意义
• 1.4 创新点
• 第2章 玉米萎蔫病菌多抗制备及ELISA检测方法建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 抗原
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 试剂及材料
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 溶液系统
• 2.1.6 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 免疫原制备
• 2.2.2 动物免疫
• 2.2.3 多抗纯化
• 2.2.4 蛋白浓度测定
• 2.2.5 抗体效价测定
• 2.2.6 抗原包被方式优化实验
• 2.2.7 抗血清工作浓度优化实验
• 2.2.8 酶标抗体使用浓度优化实验
• 2.2.9 抗血清交叉反应实验
• 2.2.10 样品检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 不同免疫个体兔之间抗体效价差异结果
• 2.3.2 不同免疫期的血清效价检测结果
• 2.3.3 两种包被方法实验结果
• 2.3.4 抗血清工作浓度优化
• 2.3.5 酶标抗体使用浓度优化
• 2.3.6 抗血清交叉反应实验
• 2.3.7 样品检测
• 2.4 讨论
• 第二部分 微流控芯片酶联免疫检测玉米萎蔫病菌
• 第1章 前言
• 1.1 微流控芯片及其发展史
• 1.2 微流控芯片免疫分析研究进展
• 1.2.1 微流控芯片免疫分析的概念
• 1.2.2 微流控芯片免疫分析的分类
• 1.2.3 微流控芯片免疫分析的应用
• 1.3 本研究的目的及意义
• 1.4 创新点
• 第2章 微流控芯片酶联免疫分析检测玉米萎蔫病菌的方法建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 抗体
• 2.1.3 试剂与材料
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 溶液系统
• 2.1.6 培养基
• 2.2 微流控免疫芯片装置与工作原理
• 2.2.1 微流控芯片装置
• 2.2.2 芯片结构及制作
• 2.2.3 微阀结构
• 2.2.4 微泵驱动与液流方式
• 2.2.5 NCM条的制作
• 2.2.6 程序软件与实验步骤
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 芯片参数确定
• 2.3.2 抗体工作浓度优化
• 2.3.3 最佳点样量优化
• 2.3.4 抗体反应时间优化
• 2.3.5 封闭液浓度对检测的影响
• 2.3.6 灵敏度实验
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 微流控芯片参数的确定
• 2.4.2 抗体工作浓度优化
• 2.4.3 点样量筛选试验结果
• 2.4.4 抗体免疫反应时间优化
• 2.4.5 封闭液浓度对检测的影响
• 2.4.6 微流控芯片酶联免疫法对Cmn的检测灵敏度
• 2.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢