大葱（Allium fistulosum L.）组织培养及其遗传转化研究

论文摘要

大葱（Allium fistulosum L.）为百合科（Liiaceae）葱属（Allium）二年生草本植物。以山东地方特产之一章丘大葱为材料,对其进行组织培养,利用农杆菌介导将几丁质酶基因转化其细胞,获得结果如下:1.建立章丘大葱愈伤组织遗传转化的受体系统。对大葱叶片、根和种子进行离体培养,诱导愈伤组织,结果表明:最佳外植体为切口处理的种子,愈伤诱导率最高为90.28%;最佳继代培养基为MS+1.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L BA,继代培养的间隔时间以15 d为好;最佳分化培养基为MS+2.0 mg/L BA,最佳生根培养基为不添加任何激素的MS培养基。2.选择剂的浓度确定。Cef抑制农杆菌生长的最佳使用浓度为300 mg/L（染菌愈伤为8.75%,愈伤组织褐化率为6.88%）。以Hyg为筛选剂,其浓度在50 mg/L时,愈伤组织停止生长,有一部分长势弱的愈伤组织死亡,75 mg/L时,愈伤组织即全部死亡。以潮霉素50 mg/L进行第一次筛选,分化培养一段时间后,再以75 mg/L进行第二次筛选效果较佳。3.培养条件的优化。采用OD600值为0.6的农杆菌悬浮液浸泡大葱愈伤组织,感染时间以1525 min为宜,以20 min为最佳。侵染后在其pH值5.6、25℃、黑暗条件下共培养3 d,所得到抗性愈伤组织的比率最高,抗性率可达5.35%。4.组织化学以及分子检测。gus基因表达的组织化学染色表明,gus基因瞬时表达率最高可达到53.08%的愈伤组织呈现蓝色,Chi基因与报告基因gus处于同一开放阅读框内,由此推断Chi基因也能表达。试验获得抗性植株48棵,其中chi-PCR阳性株为3株,阳性率为6.25%。5.目的基因的表达检测。分别对转基因和受体植株的叶片提取粗酶液检测,结果表明:转化植株的OD420吸收值最低为-0.404,明显低于未转化植株（-0.173）,说明转化植株反应产物的量比对照多,含有比对照多的几丁质酶。6.潮霉素对大葱的抑制作用。在获得的抗性植株中,分化及后期的生长非常缓慢。经对其可溶性蛋白的分析发现,潮霉素使用后表现出植物激素类似物的效应,影响了植物组织的生长和分化。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 根癌农杆菌
• 1.1.1 农杆菌的组成
• 1.1.2 T-DNA 导入植物基因组的机理
• 1.1.3 农杆菌介导的遗传转化特点
• 1.2 影响农杆菌转化单子叶植物的因素
• 1.2.1 受体
• 1.2.2 菌株和质粒载体
• 1.2.3 Vir 基因的诱导
• 1.2.4 菌液浓度
• 1.2.5 悬浮培养基
• 1.2.6 转化方式
• 1.2.7 植物培养基和外植体培养条件的影响
• 1.2.8 共培养条件
• 1.3 农杆菌介导单子叶植物的遗传转化
• 1.3.1 农杆菌介导禾本科植物主要粮食农作物的遗传转化
• 1.3.2 农杆菌介导的禾本科其余植物的遗传转化
• 1.3.3 农杆菌介导的其余单子叶植物的遗传转化
• 1.4 存在的问题与展望
• 1.4.1 转化机理
• 1.4.2 转化范围
• 1.4.3 转化策略
• 1.4.4 转基因植物安全性问题
• 1.5 本研究的目的意义及国内外研究进展
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 试验所用仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 愈伤组织的诱导及再生体系的建立
• 2.2.2 大葱遗传转化系统的建立
• 2.2.3 农杆菌介导大葱转化体系的建立
• 2.2.4 遗传转化的主要影响因素
• 2.2.5 组织化学法检测报告基因gus 的表达
• 2.2.6 转基因植株的分子生物学鉴定
• 2.2.7 几丁质酶活性测定
• 2.3 潮霉素对大葱的影响
• 2.3.1 潮霉素对大葱组培幼苗生长的影响
• 2.3.2 潮霉素对愈伤分化的影响
• 2.3.3 潮霉素对愈伤组织可溶性蛋白含量的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 愈伤组织的诱导及再生体系的建立结果
• 3.1.1 不同外植体愈伤诱导
• 3.1.2 琼脂浓度对愈伤组织玻璃化的影响
• 3.1.3 培养条件对愈伤组织玻璃化的影响
• 3.1.4 培养条件对愈伤组织褐化的影响
• 3.1.5 分化培养基对愈伤组织分化的影响
• 3.1.6 愈伤组织在生根培养基上的生根情况
• 3.1.7 试管苗的驯化移栽
• 3.2 大葱遗传转化系统的建立
• 3.2.1 抗生素敏感浓度的确定
• 3.2.2 农杆菌介导大葱遗传转化中的几个参数优化
• 3.2.3 gus 基因表达的组织化学染色
• 3.2.4 PCR 检测结果
• 3.2.5 几丁质酶活性测定
• 3.3 潮霉素对大葱的抑制作用
• 3.3.1 潮霉素对大葱组培幼苗生长的影响
• 3.3.2 潮霉素对愈伤分化的影响
• 3.3.3 潮霉素对愈伤组织可溶性蛋白含量的影响
• 4. 讨论
• 4.1 建立大葱再生体系时的问题
• 4.1.1 外植体与愈伤率
• 4.1.2 外植体与基因转化
• 4.2 农杆菌的去除对转化率的影响
• 4.3 筛选
• 4.4 转化条件的影响
• 4.4.1 共培养的影响
• 4.4.2 农杆菌的侵染时间以及菌液浓度
• 5 结论
• 5.1 章丘大葱再生体系的建立
• 5.2 农杆菌介导的大葱遗传转化系统的建立
• 5.2.1 选择剂浓度的确定
• 5.2.2 农杆菌侵染大葱愈伤组织进行基因转化的适宜条件
• 5.3 组织化学以及分子检测
• 5.4 潮霉素对大葱的抑制生理作用
• 参考文献
• 致谢
• 图版说明
• 攻读学位期间发表论文情况