论文题目: 重组人白细胞介素-15的原核表达和治疗肿瘤的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 免疫学
作者: 唐峰
导师: 何维,崔莲仙
关键词: 人重组白细胞介素,原核表达和纯化,小鼠肺腺癌细胞,小鼠黑色素瘤细胞
文献来源: 中国协和医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 白细胞介素-15（IL-15）是Grabstein等人于1994年发现的一种具有免疫调节活性的细胞因子，它具有与白细胞介素-2（IL-2）相似的生物学功能，可促进T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK）的增殖与分化，增强细胞毒T细胞（CTL）／NK细胞的细胞毒活性等，并能发挥优于IL-2的抗肿瘤作用。 本论文是在我们的前期工作基础上，通过基因工程技术和蛋白质纯化技术获得了纯度在95％以上的重组人白细胞介素-15（rhIL-15），并用建立的小鼠肿瘤模型，研究了rhIL-15的抗肿瘤作用，为将rhIL-15开发成一类抗肿瘤新药奠定了基础。本论文工作主要研究内容包括三部分：（1）rhIL-15的原核表达、纯化和鉴定；（2）抗rhIL-15单克隆抗体的制备；（3）rhIL-15的急性毒性实验和抗肿瘤作用研究。 （1）rhIL-15的原核表达、纯化和鉴定 根据已知人白细胞介素-15（hIL-15）成熟蛋白的氨基酸序列，在不改变氨基酸序列的前提下，采用大肠杆菌偏爱密码子合成寡核苷酸片段，通过拼接PCR法成功合成hIL-15基因，分别插入原核表达载体pGEX-2T、pET30a、pET42、pETBlue-1或pBV220，在多种宿主菌中获得了表达，最后筛选到稳定高效表达rhIL-15的工程菌株，即BL21StarTM（DE3）plysS／pBV220-IL-15。在工程菌BL21StarTM（DE3）plysS／pBV220-IL-15中，rhIL-15以包涵体形式表达，最高表达量为菌体总蛋白的15.2％。经蛋白印迹法鉴定表明，此rhIL-15能与抗hIL-15的单克隆抗体特异结合。诱导表达后，分离出包涵体，经反复洗涤后，溶于6mol／L盐酸胍，获得rhIL-15粗品。再经反相层析分离后溶于8mol／L尿素，经透析或稀释复性获得有生物活性的rhIL-15，复性后的rhIL-15依次经DEAE弱阴离子交换层析和Sephadex G-25脱盐得到纯化的rhIL-15。纯化的rhIL-15行SDS-PAGE鉴定及光密度扫描分析，结果显示，纯度在95％以上。N端氨基酸序列分析结果表明，此rhIL-15 N端的前15个氨基酸序列与预期的一致；毛细管电泳分析表明，纯化rhIL-15的纯度接近100％，等电点为4.14，接近rhIL-15的等电点理论值4.42。纯化rhIL-15的体外促CTLL-2细胞增殖活性为6.7×106U／mg。因此，可以确定分离纯化的表达蛋白即是rhIL-15。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
英文缩略词表
前言
第一部分 rhIL-15的原核表达、纯化和鉴定
一、实验材料
1. 菌株
2. 质粒载体
3. 工具酶
4. 主要化学试剂
5. 其他材料
6. 主要仪器和设备
7. 主要溶液配方
8. 引物及合成hIL-15成熟蛋白编码基因的寡核苷酸片段
二、实验方法
1. 拼接PCR法合成hIL-15成熟蛋白的编码基因
2. 质粒DNA的提取
3. DNA重组
4. 重组蛋白在E.coli中的表达和纯化
5. 重组蛋白理化性质及生物学活性测定
三、结果
1. 非融合表达载体pBV_(220)/hIL-15的构建
2. rhIL-15的诱导表达
3. rhIL-15的分离纯化
4. rhIL-15的理化性质鉴定
四、讨论
第二部分 抗rhIL-15单克隆抗体的制备
一、材料
1. 实验动物
2. 主要试剂及抗体
3. 溶液配制
二、方法
1. 抗原的制备
2. 免疫小鼠
3. 单克隆抗体的制备
4. 抗体的鉴定
5. 腹水的制备
6. 抗体纯化
7. 抗体亚型测定
三、结果
1. 抗rhIL-15单克隆抗体的制备
2. 单克隆抗体的鉴定
四、讨论
第三部分 rhIL-15的急性毒性和抗肿瘤作用研究
一、实验材料
1. 细胞株
2. 实验动物
3. 主要药品和试剂
4. 主要仪器和设备
5. 培养基的配制
6. 主要溶液配制
二、实验方法
(一) 组织学实验方法
(二) 免疫学实验方法
(三) rhIL-15急性毒性实验方法
(四) rhIL-15体内药效学实验方法
三、结果
(一) rhIL-15急性毒性实验
(二) rhIL-15体内药效学实验
四、讨论
(一) rhIL-15急性毒性
(二) rhIL-15体内药效学
小结
参考文献
综述
个人简历
致谢
发布时间: 2006-10-13
参考文献
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