论文摘要
第一部分Buffalo大鼠移植型肝癌模型的生物学特点及影像表现目的评价一种新的大鼠原位肝细胞癌模型的磁共振、数字减影血管造影、生物学特点变化及病理特征,促进大批量小动物肝细胞癌介入治疗研究。材料和方法将McA-RH7777细胞开腹直视下接种于30只Buffalo大鼠肝左或右叶。造模后第7和14天行MRI平扫及增强扫描并分别取荷瘤大鼠各3只行病理检查。14天后荷瘤鼠14只分别经胃十二指肠动脉（7只）或静脉（7只）插管行肝动脉和门静脉造影,了解移植瘤DSA血供特点。其余10只荷瘤鼠长期观察生存状况。结果造模后第7天,MRI观察见30只大鼠均有肿瘤生长,肿瘤平均体积为19.53±15.65mm3;14天后增大到400.33±242.34 mm3。肿瘤在T1WI为低信号,T2WI为高信号,增强后呈结节状或明显不均匀强化。7例大鼠DSA显示肿瘤供血动脉均有不同程度增粗扭曲,实质期呈结节状染色3例或环状不均匀染色4例。7只大鼠门静脉造影均无明显供血。肿瘤包膜完整,中央可见坏死。免疫组化显示肿瘤甲胎蛋白呈强阳性表达。10只荷瘤大鼠平均生存期为50.80±4.44天。结论Buffalo大鼠McA-RH7777肝细胞癌,具有同人类肝细胞肝癌相似的MRI和DSA表现,非常适于进行大批量的介入治疗实验研究。第二部分厌氧条件下长双歧杆菌对体外培养的McA-RH7777肝癌细胞生长及VEGF表达的影响目的:探索厌氧条件下长双歧杆菌对体外培养的大鼠McA-RH7777肝癌细胞的毒性及对其VEGF表达及分泌的影响。材料和方法:采用细胞培养技术,以大鼠肝癌细胞McA-RH7777为靶细胞,将McA-RH7777肝癌细胞分为两组,A组（厌氧培养条件下加入长双歧杆菌）和B组（单纯厌氧培养）。处理后肝癌细胞6h、12h、24h、48h、72h后,利用WST-1比色法测定长双歧杆菌对癌细胞毒性（OD值）。应用ELISA测定上清液中0h、12h、24h、48h、72h VEGF蛋白含量,使用RT-PCR法分析厌氧培养72h后两组细胞VEGFb表达水平。结果:将长双歧杆菌加入体外培养的McA-RH7777肝癌细胞中显示出细胞毒性和对该细胞系的抑制效应。作用12h后,细胞生长开始出现停滞呈球形;细胞浆内出现颗粒状物。72h后培养液内细胞碎片出现。厌氧培养条件下,细胞损伤随时间的延长逐渐加重,A组毒性更大,48小时后两组OD值具有显著差异。上清液中VEGF蛋白含量在0h、12h、24h、48h、72h时两组相比均无明显统计学差异。72小时后A组厌氧培养的细胞VEGF mRNA表达水平明显高于B组。结论:在厌氧条件下长双歧杆菌对体外培养的McA-RH7777肝癌细胞具有明显毒性。癌细胞VEGF mRNA表达上调,但上清液中总VEGF含量在各时间点均未见显著增高。第三部分MRI检测超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记长双歧杆菌和C.novyi-NT的实验研究目的探索超顺磁性氧化铁标记长双歧杆菌或C.novyi-NT及采用MRI检测的可行性。材料与方法体外实验中四组不同组分的培养管厌氧条件下培养:（1）B.longum-SPIO组（n=6）:PYG液态培养基+B.longum+SPIO;（2）Free-SPIO组（n=6）:PYG液态培养基+SPIO;（3）B.longum组（n=6）:PYG液态培养基+B.longum;（4）Medium组（n=6）:PYG液态培养基。厌氧培养72小时后B.longum-SPIO和B.longum组取材行透射电镜和普鲁士蓝染色。各组培养管行T2*mapping和T2 mapping MRI扫描,并重建出R2*mapping和R2 mapping,测量R2*和R2值。同样的处理方法（RCM培养基）用来标记和检测C.novyi-NT。建立Baffulo大鼠肝癌皮下瘤模型及肝原位瘤模型各8只用于体内实验。大鼠皮下瘤直接瘤内注射B.longum-SPIO（28μg Fe/ml）及Free-SPIO（28μg Fe/ml）各l ml。大鼠种植性肝癌静脉注射B.longum-SPIO（28μg Fe/ml）各1 ml。15天后检查MRI信号改变及病理切片普鲁士蓝染色检测瘤内是否有铁颗粒存在。结果标记SPIO后B.longum活性没有受到明显影响。电镜见细菌体内形成较大铁颗粒,普鲁士蓝染色可见细菌铁染色明显。B.longum-SPIO R2*值明显高于Free-SPIO值（P＜0.001）,而B.longum R2*值同培养基R2*值无显著差异（P＞0.05）。在R2上Free-SPIO信号值明显高于B.longum-SPIO值（P＜0.001）,而B.longum同培养基R2值无明显差异（P＞0.05）。通过B.longum-SPIO和Free-SPIO比较发现在铁浓度相同情况下,B.longum-SPIO的R2*值明显高于Free-SPIO R2*值。相反,Free-SPIO R2值明显高于B.longum-SPIO R2值。B.longum-SPIO R2和R2*效应同细菌数呈线性关系。R2*效应斜率是R2效应斜率的31.25倍。Free-SPIO浓度同R2*效应亦呈线性关系,其R2*效应的斜率仅为R2效应斜率的1.99倍。C.novyi-NT也有类似的表现。大鼠肝癌皮下瘤显示注射B.longum-SPIO瘤体在R2*上信号明显高于注射Free-SPIO的瘤体,而R2信号则明显低于注射Free-SPIO的瘤体。尾静脉注射B.longum-SPIO后T2WI显示瘤体内见散在低信号区。T2*WI显示瘤体内低信号较T2WI更加明显。铁染色后坏死区内广泛存在铁染色颗粒,有些区域见聚集的与细菌形态一致的杆状铁染色颗粒。结论SPIO可以用来标记长双歧杆菌和C.novyi-NT并带来分布改变,同时引起相应的R2和R2*效应改变,并可以用来示踪瘤内长双歧杆菌或C.novyi-NT。第四部分长双歧杆菌联合化疗及经皮无水酒精注射治疗Buffalo大鼠皮下移植肝癌目的:探索长双歧杆菌治疗联合化疗及无水酒精瘤内注射治疗Buffalo大鼠皮下McA-RH7777肝细胞癌的疗效及可能机制。材料和方法:建立40只Buffalo大鼠皮下肝癌动物模型,14天后随机分为四组:对照（Control）组（C组,n=10）;长双歧杆菌溶瘤（B.longum）组（B组,n=10）;经皮无水酒精注射和丝裂霉素化疗疗（Ethanol+MMC）组（EM组,n=10）;长双歧杆菌溶瘤联合经皮无水酒精注射及丝裂霉素化疗（Ethanol+B.longum+MMC）组（EBM组,n=10）。在3、6、9、12、15天行磁共振检查计算瘤体积及相对瘤体积,比较瘤体增长情况。15天后处死全部大鼠行病理,免疫组化及细菌培养。结果:40只Buffalo大鼠肿瘤模型全部建模成功。处理后C组和B组瘤体持续生长,而EM组和EBM组肿瘤生长明显受到抑制,瘤体积缩小。经两两比较后发现C组同B组之间相对瘤体积没有显著差异,同EM组或EBM组相比具有明显差异。EM的相对瘤体积同EBM的相对瘤体积也有显著差异。经EM处理后VEGF表达明显增强,加用B.longum处理后表达减弱,单独应用B.longum并未见VEGF表达明显减弱。6只EM组大鼠出现不同程度腹泻。EM组1例,EBM组2例出现皮肤坏死。各脏器尸检时均未见有脓肿形成。革兰氏染色显示长双歧杆菌可在肿瘤坏死区内聚集生长,呈片状,分布相对局限。处死后细菌培养见瘤组织内有大量细菌,而肝、肺、心、肾脏和脾脏均未见明显菌落形成。结论:长双歧杆菌联合经皮无水酒精注射及化疗可有效抑制大鼠McA-RH7777肝细胞癌生长,长双歧杆菌在瘤内定植繁殖可能会减低局部VEGF表达。第五部分肝动脉化疗栓塞联合无毒诺氏梭菌孢子瘤内注射治疗兔VX2肝癌目的:探索无毒诺氏梭菌孢子（C.novyi-NT）联合动脉化疗栓塞治疗新西兰大白兔兔VX2肝癌的疗效。材料和方法:将无毒诺氏梭菌孢子经过至少14天厌氧培养产孢并纯化后备用。制作新西兰大白兔VX2肝癌模型40只,MRI确定肿瘤存在并测量肿瘤大小,随机分成4组,即假手术组（A组,n=8）、经动脉化疗栓塞（TACE）组（B组,n=8）、动脉化疗栓塞加瘤内注射C.novyi-NT组（C组,n=12）、瘤内注射C.novyi-NT组（D组,n=12）。C、D两组处理后1、3、7、14天各处死一只动物取材（每个肿瘤随机取3枚组织块）行细菌培养,1微升组织块匀浆厌氧培养检测瘤内定植的活菌。各组于治疗后21天时行MRI复查并各处死2只行病理检查及细菌培养。每组6只长期观察疗效及并发症。结果:成功培养和纯化诺氏梭菌孢子。所有动物完成所有相应治疗操作。处理后21天四组相对肿瘤体积具有显著统计学差异（x2=18.74,P＜0.001,Kruskal-Wallace H test）。四组间坏死比例相比C组＞B组＞D组＞A组,四组间具有显著统计学差异（P＜0.001,Kruskal-Wallace test）。A、B、C、D四组平均生存时间分别为30.83±3.98天、63.33±4.57天、86.50±2.93天和44.67±2.81天。Kaplan Meier生存分析曲线显示C组累计生存率明显比其它三组明显增高。C组和D组在瘤内注射C.novyi-NT孢子后24小时即可在瘤内检测出活菌,3天后活菌数明显增加,至14天时达到最高峰,随后活菌数稍有减少。TACE结合C.novyi-NT瘤内注射组肿瘤呈较硬结节,瘤组织切面呈淡黄色,镜下肿瘤坏死程度和范围明显较其它三组明显。结论:肝动脉化疗栓塞联合C.novyi-NT瘤内注射显增加肿瘤坏死,缩小瘤体,延长荷瘤兔生存期。结论一、Buffalo大鼠McA-RH7777肝细胞癌具有同人类肝细胞肝癌相似的MRI和DSA表现,非常适于进行大批量的介入治疗实验研究。二、在厌氧条件下,长双歧杆菌对体外培养的McA-RH7777肝癌细胞具有毒性作用,并可能对癌细胞VEGF表达产生影响。三、超顺磁性氧化铁（SPIO）可以用来标记长双歧杆菌及诺氏梭菌孢子,并引起明显的磁共振信号的变化。四、长双歧杆菌可在无水酒精制造的坏死区内大量繁殖,长双歧杆菌联合无水酒精和化疗可有效抑制大鼠McA-RH7777肝细胞肝癌生长,长双歧杆菌在瘤内生长繁殖可能通过破坏和杀灭瘤内乏氧细胞有效抑制由于乏氧引起的VEGF的表达和分泌。五、TACE联合C.novyi-NT孢子治疗兔VX2肝癌可有效增加肿瘤坏死,缩小肿瘤体积,延长动物生存期。TACE可在短时间内增加C.novyi-NT孢子在肿瘤内的定制增殖。创新点一、在国内首次采用McA-RH7777细胞建立大鼠肝癌模型并对其MRI、DSA及病理特点进行描述。二、首创采用超顺磁性氧化铁（SPIO）标记长双歧杆菌及诺氏梭菌孢子（C.novyi-NT）,并描述了相应磁共振信号的变化。三、首次采用厌氧菌（C.novyi-NT或B.longum）同介入治疗手段（TACE或PEI）结合治疗实验性肝癌。四、厌氧菌对厌氧区乏氧肿瘤细胞的破坏可能导致乏氧引起的VEGF表达和分泌减少,这一作用可能是其抗肿瘤间接作用的机制之一。
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