壬基酚的荧光定量PCR检测新方法研究

论文摘要

壬基酚（nonylphenol,NP）是环境内分泌干扰物质中具有代表性的物质,且化学性质比较稳定,易富集于沉积物中,不易降解,暴露到环境中可导致生物与人体的性激素分泌量及活性下降,精子数量减少,生殖器官异常,癌症等疾病的发病率增加,并使生殖能力降低,后代的健康与成活率下降,同时还可能影响到各种生物的免疫系统和神经系统,也可能导致生物基因突变等。目前壬基酚的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱一质谱法联用和高效液相色谱法、液相色谱-质谱法,后来又发展成固相萃取、吹扫捕集与气相色谱法联用,免疫分析方法和化学发光法偶有报道。用色谱法不仅昂贵费时,而且分析过程繁琐冗长。近年来,随着生物技术的发展产生了许多壬基酚的生物检测方法。生物检测中,PCR检测技术由于其灵敏度高,检测限更低,受到了广泛关注。SYBR GreenⅠ荧光定量PCR是近年来出现的具有高灵敏度的定量PCR方法。目前,在壬基酚检测领域,PCR技术主要应用检测壬基酚的雌激素效应,直接用于检测环境样本中壬基酚的含量的研究报导较少。本文采用体外DNA结合实验,结合外切酶消解与荧光定量PCR技术,建立一种壬基酚的荧光定量PCR检测新方法。壬基酚可以活化雌激素受体,使之与包含特定序列的双链DNA结合,结合的DNA因受到蛋白质的保护可抵抗核酸外切酶ExonucleaseⅢ的消解而被保留下来,痕量的保留DNA可通过PCR扩增出来。根据此原理,本研究首先从鱼肝脏中提取含雌激素受体的细胞溶质,与不同浓度的壬基酚结合使雌激素受体活化,形成受体-配体复合物。再设计合成特异性引物序列,采用常规PCR方法扩增制备双链结合DNA;使双链结合DNA与受体-配体复合物反应结合后,用核酸外切酶和S1酶消解,去除未受到蛋白质保护的结合DNA。将消解后产物作为模板,进行荧光定量PCR扩增反应,从而建立Ct值与壬基酚浓度的标准曲线。同时探索最优反应条件,并确定荧光定量PCR的最低检测限及其结果的重复性。将该方法用于检测实际环境样品中壬基酚的含量,并将检测结果同高效液相色谱法进行比较,比较两种检测方法的不同。本课题主要试验结果表明:（1）壬基酚暴露条件下,鱼体内可产生较多的雌激素受体;实验中采用羟基磷灰石微量法,将配体受体复合物纯化,效果显著,可减少PCR实验中的非特异性扩增。采用SPR定性鉴定受体-配体复合效果,在加入壬基酚标准溶液浓度为10-8-10-2g/L范围内,壬基酚配体浓度与受体-配体复合物的SPR响应强度之间呈线性关系。（2）以已知拷贝数的DNA做定量标准曲线,之后根据标准曲线,及不同浓度壬基酚对应的模板拷贝数,得到壬基酚浓度与Ct的关系曲线,为:Ct=-1.828×log（壬基酚浓度）+11.447。分析可知,壬基酚浓度为10-8-10-2mol/L时,线性关系显著（R2=0.99523）。确定本实验建立的荧光定量PCR法对壬基酚的最低检测限为10-8mol/L。（3）高效液相色谱法检测壬基酚及与PCR方法的比较:论文建立了高效液相色谱法的标准直线,考察了方法的检测限并应用于实际环境样品的检测,结果令人满意。并将该方法的各项指标与本论文首次建立的荧光定量PCR分析方法进行比较,就其优缺点进行了讨论。本试验建立的荧光定量PCR方法检测壬基酚,具有检出限低,重现性好,可同时处理大批量样本等优点。本研究将改进的酶切保护反应与PCR技术结合起来,建立了一种新的壬基酚检测方法,该方法灵敏度极高,操作简便,可作为一种有效的痕量壬基酚生物筛选及定量检测方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 环境激素
• 1.2 NP的概况
• 1.2.1 NP的性质及其分布
• 1.2.2 NP的激素作用及危害
• 1.3 壬基酚雌激素效应的作用机理
• 1.4 检测方法
• 1.5 实时荧光定量PCR技术概述
• 1.5.1 实时荧光定量PCR技术的发展
• 1.5.2 实时荧光定量PCR技术的基本原理
• 1.6 本课题内容构成
• 1.6.1 课题的研究目的和意义
• 1.6.2 课题的研究内容和技术路线
• 第二章 受体的提取及受体-NP的复合与纯化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验药品
• 2.1.3 常用试剂的配制
• 2.1.4 供试动物及驯养
• 2.1.5 实验装置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 含受体的细胞溶质的提取（所有过程都在冰上进行）
• 2.2.2 蛋白质含量的测定
• 2.2.3 受体-配体复合
• 2.2.4 SDS-PAGE法分析HAP对受体-NP的纯化情况
• 2.2.5 受体-配体复合效果SPR鉴定
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 SDS-PAGE结果与分析
• 2.3.2 壬基酚受体-壬基酚结合情况
• 2.4 小结
• 第三章 受体-NP-结合DNA的制备与定性PCR分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验仪器设备
• 3.1.2 实验器材
• 3.1.3 实验药品
• 3.1.4 常用试剂的配制
• 3.2 结合DNA的制备
• 3.2.1 引物的合成
• 3.2.2 引物的处理
• 3.2.3 PCR体系的优化
• 3.2.4 DNA的回收
• 3.2.5 定量结合DNA
• 3.3 受体、配体、结合DNA复合物的制备
• 3.4 常规PCR反应
• 3.4.1 常规PCR半定量检测壬基酚
• 3.4.2 对照组结果
• 第四章 荧光定量PCR检测壬基酚方法的建立
• 4.1 实验仪器、材料和试剂
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 实验材料和试剂
• 4.2 SYBR Green I定量标准曲线的建立
• 4.3 熔解曲线分析
• 4.4 SYBR Green I荧光定量PCR检测壬基酚
• 4.5 荧光检测的检测限
• 4.6 小结
• 第五章 荧光定量PCR检测环境样品中壬基酚
• 5.1 样品的预处理
• 5.1.1 水中壬基酚的提取
• 5.1.2 土壤中壬基酚的提取
• 5.1.3 鱼肝脏中壬基酚的提取
• 5.2 荧光定量PCR检测环境样品中壬基酚
• 5.2.1 荧光定量PCR检测水中壬基酚
• 5.2.2 荧光定量PCR检测土壤中壬基酚
• 5.2.3 荧光定量PCR检测鱼肝脏中壬基酚
• 5.3 小结
• 第六章 高效液相色谱法检测壬基酚
• 6.1 实验仪器、材料和试剂
• 6.1.1 实验仪器
• 6.1.2 实验材料和试剂
• 6.1.3 高效液相色谱操作步骤
• 6.2 HPLC测定壬基酚
• 6.2.1 高效液相色谱检测条件
• 6.2.2 标准曲线的绘制
• 6.2.3 高效液相色谱检测水中壬基酚
• 6.2.4 高效液相色谱检测土壤中壬基酚
• 6.2.5 高效液相色谱检测鱼肝脏中壬基酚
• 6.3 小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ 缩略语
• 附录Ⅱ PUC19序列
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢