耐热性酶的固定化初步研究

论文摘要

耐热酶即热稳定性酶,它是一类在高温下仍能保持一定活性的酶的总称。耐热酶不仅具有化学催化剂无法比拟的优点,如催化效率高和底物专一性强,而且酶在高温条件下的稳定性极好。因而它可以克服中温酶（20℃55℃）及低温酶（-2℃20℃）在应用过程中常常出现的生物学性质不稳定的现象,从而使很多高温化学反应过程得以实现。但游离酶只能使用一次即抛弃,而固定化酶作为生物催化剂可多次重复利用、稳定性、操作简单和产物易于分离纯化等优点,因此对其进行固定化研究具有重要意义。论文首先制备包埋载体颗粒,并考察了制备条件对颗粒性质的影响。在此基础上制备出两种凝胶颗粒,海藻酸钙凝胶颗粒和聚乙烯醇凝胶颗粒。通过对两种凝胶颗粒性能的比较,选择了性能较好的海藻酸钙凝胶颗粒作为包埋固定化载体。采用包埋-交联法制备了固定化葡萄糖异构酶,通过单因素实验得出固定化葡萄糖异构酶的较优条件为:酶液与海藻酸钠体积比1∶2混合,戊二醛浓度为0.01%,凝胶浓度为30 g/L,CaCl2浓度为0.2 mol/ L,固定化时间为6 h。通过对不同温度下固定化颗粒酶蛋白变化实验,推断酶蛋白泄漏可能是固定化颗粒使用过程中受温度影响的主要原因。尝试了不同功能基团的树脂进行固定化研究,通过筛选最终选用D380阴离子交换树脂作为固定化载体,采用吸附交联法固定化酶。通过实验对加酶量、交联剂浓度、吸附时间、吸附pH等能够影响固定化酶活力回收率的因素的研究和优化,得出较优的α-淀粉酶固定化条件为:戊二醛浓度0.005 %、处理时间45 min、加酶量3 mg/ g （蛋白量/载体）、酶液pH 5.8、25℃、固定化处理时间为6～10 h,获得的固定化酶活力为80 U/ g （载体）。较优的葡萄糖异构酶固定化条件为:戊二醛浓度0.01 %、处理时间45 min、加酶量10 mg/ g （蛋白量/载体）、酶液pH 7.0、30℃、固定化处理时间为8 h,获得的固定化酶活力为600 U/ g （载体）。研究固定化葡萄糖异构酶的酶学性质,得到其最适温度为90℃,最适pH为7.0,较游离酶有更宽泛的酸碱稳定范围以及热稳定性较高,固定化酶的表观Km为602 mmol/L,比游离酶较大。考察不同底物浓度对葡萄糖转化率的影响,固定化酶重复利用6次,转化率维持在50%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 耐热酶的研究
• 1.1.1 耐热酶的来源和特性
• 1.1.2 耐热酶的应用
• 1.1.3 目前已开发的耐热酶
• 1.2 固定化酶的概述
• 1.2.1 固定化酶的研究背景
• 1.2.2 固定化酶的特点
• 1.2.3 酶的固定化方法
• 1.2.4 酶固定化载体的研究
• 1.3 α-淀粉酶和葡萄糖异构酶的固定化
• 1.3.1 α-淀粉酶的固定化
• 1.3.2 葡萄糖异构酶的固定化
• 1.4 本论文研究意义及主要内容
• 1.4.1 本论文研究的意义
• 1.4.2 本论文研究的主要内容
• 第二章 包埋载体的制备及性质
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 实验试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 包埋载体的制备
• 2.3.2 凝胶颗粒性能的检测方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 海藻酸钙凝胶颗粒制备条件的初步研究
• 2.4.1.1 SA 浓度对凝胶颗粒性质的影响
• 2浓度对凝胶颗粒性质的影响'>2.4.1.2 CaCl₂浓度对凝胶颗粒性质的影响
• 2.4.1.3 凝胶反应时间对凝胶性质的影响
• 2.4.2 聚乙烯醇凝胶颗粒制备条件的初步研究
• 2.4.2.1 PVA 浓度的确定
• 2.4.2.2 海藻酸钠添加量的确定
• 2.4.2.3 交联剂的影响
• 2.4.3 两种凝胶颗粒性能的比较
• 2.4.3.1 小球颗粒的外观结构
• 2.4.3.2 热稳定性比较
• 2.4.3.3 强度比较
• 2.4.3.4 传质性能比较
• 2.4.3.5 介质环境对海藻酸钙小球的影响
• 2.5 小结
• 第三章 海藻酸钙包埋固定化酶
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要仪器
• 3.2.2 实验试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 葡萄糖异构酶的提取
• 3.3.1.1 菌种
• 3.3.1.2 发酵培养与酶提取
• 3.3.2 固定化酶的制备
• 3.3.3 蛋白浓度的测定
• 3.3.4 酶活力的测定
• 3.3.4.1 α-淀粉酶的酶活测定
• 3.3.4.2 葡萄糖异构酶的酶活测定
• 3.3.5 酶活收率
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 海藻酸钙固定化α-淀粉酶和葡萄糖异构酶
• 3.4.2 海藻酸钙包埋固定化葡萄糖异构酶
• 3.4.2.1 酶与海藻酸钠载体配比的影响
• 3.4.2.2 海藻酸钠浓度的影响
• 2浓度的确定'>3.4.2.3 CaCl₂浓度的确定
• 3.4.2.4 固定化时间的影响
• 3.4.2.5 交联－包埋法固定化葡萄糖异构酶
• 3.4.2.6 包埋－交联法固定化葡萄糖异构酶
• 3.4.3 固定化葡萄糖异构酶的操作稳定性
• 3.5 小结
• 第四章 树脂交联法固定化酶的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 实验材料
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 固定化载体的预处理
• 4.3.2 固定化酶的制备
• 4.3.2.1 载体选择
• 4.3.2.2 固定化条件优化
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 载体的选择
• 4.4.2 加酶量对固定化效果的影响
• 4.4.3 pH 对固定化效果的影响
• 4.4.4 固定化时间的影响
• 4.4.5 温度对固定化效果的影响
• 4.4.6 戊二醛浓度对固定化效果的影响
• 4.4.7 戊二醛处理时间对固定化效果的影响
• 4.5 小结
• 第五章 固定化酶的酶学性质及应用的研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 主要仪器
• 5.2.2 实验材料
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 反应条件对酶活性及稳定性的影响
• 5.3.2 固定化葡萄糖异构酶重复利用的稳定性
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 最适pH
• 5.4.2 最适温度
• 5.4.3 温度稳定性
• 5.4.4 酸碱稳定性
• 5.4.5 酶的动力学参数
• 5.4.6 固定化酶操作稳定性
• 5.4.6.1 不同底物浓度对葡萄糖转化率的影响
• 5.4.6.2 固定化酶重复使用的稳定性
• 5.5 小结
• 结论与展望
• 一、主要结论
• 二、展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文