一色齿毛菌胞外漆酶的纯化及部分酶学性质的研究

论文摘要

漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜离子的多酚氧化酶,他们由于含有的木素氧化酶系而能够降解许多不同种化学结构的染料,因此广泛应用于工业生产的各领域中。本文利用单因素和L9（34）正交实验优化了一色齿毛菌（Cerrena unicolor）胞外漆酶的产生条件。结果表明优化的一色齿毛菌产漆酶培养基组成为:蔗糖10g/L,蛋白胨1 g/L,CuSO4·5H2O 0.2 mM,诱导剂为藜芦醇0.5 mM,pH值为5.0。培养条件为28℃,160r/min振荡培养。以该培养基为发酵培养基,液体培养一色齿毛菌,在培养的第18天后收集培养液,利用超滤、离子交换树脂DEAE-Sepharose FF和Sephaex G-75凝胶过滤技术进行了漆酶的分离纯化,纯化倍数为3.12,回收率为26.61。纯化的漆酶经SDS-PAGE检测为单一蛋白,分子量为63.77 kDa。以ABTS为底物,纯化漆酶的酶学性质研究表明最适pH2.2,最适反应温度为50℃。以ABTS、丁香醛连氮和DMP（2,6-dimethoxyphenol）为底物对应的Km值分别为0.217 mM、0.306 mM和0.199 mM。几种漆酶的抑制剂中,NaN3对漆酶的活力有强烈的抑制,而1mM半胱胺酸和二硫疏糖醇有部分抑制作用,而即使50mM的EDTA对漆酶抑制程度仍然很低。本文选取了几种不同种类染料用于纯化漆酶的染料降解研究,结果表明所有染料均能在不添加小分子介体物质的条件下被降解。其中降解效果最好的是蒽醌类的RBBR,10min的降解率达到90%,3h降解率达到95.7%。结果显示了一色齿毛菌漆酶在染料降解的应用上很强的工业应用潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 漆酶的来源
• 1.3 漆酶的结构特征
• 1.4 漆酶的催化特点
• 1.4.1 漆酶的底物专一性
• 1.4.2 漆酶的催化作用
• 1.5 漆酶的应用前景
• 1.5.1 环境保护
• 1.5.2 造纸工业
• 1.5.3 医药用途
• 1.5.4 食品加工
• 1.5.5 鉴定菌种属种
• 1.5.6 生物检测
• 1.6 本课题来源及主要研究内容
• 1.6.1 课题来源
• 1.6.2 论文研究内容
• 2 菌种鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 药品
• 2.1.3 供试培养基及其配方
• 2.1.4 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌丝体培养及收集
• 2.2.2 菌株的ITS-PCR扩增
• 2.2.3 ITS片段的回收与纯化
• 2.2.4 菌落PCR进行阳性克隆的检测
• 2.2.5 ITS片段的测序
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌株的ITS-PCR扩增结果
• 2.3.2 阳性克隆的检测
• 2.3.3 测序结果
• 2.4 本章小结
• 3 一色齿毛菌胞外漆酶培养条件的优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 药品
• 3.1.3 仪器和设备
• 3.1.4 基本培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 接种及培养
• 3.2.2 一色齿毛菌胞外漆酶的生长曲线的绘制
• 3.2.3 培养条件优化的单因素实验
• 3.2.4 培养条件优化的正交实验
• 3.2.5 漆酶活力的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 一色齿毛菌漆酶的生长曲线
• 3.3.2 单因素实验结果
• 3.3.3 正交试验结果
• 3.4 本章小结
• 4 一色齿毛菌胞外漆酶的纯化
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 药品
• 4.1.3 仪器
• 4.1.4 培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 培养方法
• 4.2.2 样品的制备
• 4.2.3 蛋白含量的测定
• 4.2.4 纯化步骤
• 4.2.5 凝胶电泳检验纯化后的漆酶
• 4.2.6 pH值对漆酶的活性和稳定性的影响
• 4.2.7 温度对漆酶的活性和稳定性的影响
• 4.2.8 抑制剂和动力学参数对漆酶活性的影响
• 4.2.9 漆酶对染料的脱色试验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 漆酶纯化的结果
• 4.3.2 pH值对漆酶活性和稳定性的影响
• 4.3.3 温度对漆酶活性和稳定性的影响
• 4.3.4 抑制剂和动力学参数对漆酶活性的影响
• 4.3.5 漆酶对染料的脱色试验
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢