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氯化镧诱导MDCC-MSB1细胞凋亡机制的研究

2020-12-02阅读(243)

氯化镧诱导MDCC-MSB1细胞凋亡机制的研究

论文摘要

许多研究表明,一定浓度稀土具有显著的抑癌作用。随着稀土在医药、生物化学等领域研究的不断深入,其在生命科学中的地位日益重要。鸡MD的许多特性与哺乳动物肿瘤的发生有相似之处,被作为研究肿瘤性疾病的良好模型。本课题以体外培养MDCC-MSB1细胞系为研究对象,在培养体系中加入不同浓度LaCl3,应用流式细胞术、原位末端标记、DNA电泳分析、荧光染色、电子显微镜等方法,从细胞超微结构、细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)、染色体DNA损伤、细胞周期、线粒体膜电位（Δψm）、Caspase-3、Caspase-9活性及CaM、Caspase3 mRNA表达水平等方面,研究LaCl3诱导MDCC-MSB1凋亡的形态学改变、生物化学改变及可能的调控机制,为临床应用LaCl3治疗MD及其他肿瘤性疾病提供理论依据。研究结果表明:1应用MTT比色法、二硝基苯肼比色法检测MDCC-MSB1细胞的活性和培养上清液中LDH活性,结果表明各浓度组LaCl3均可以抑制MDCC-MSB1细胞增殖,应用PI染色流式细胞术检测法检检测细胞周期变化,RT-PCR方法检测CaMm RNA表达水平,结果表明LaCl3可诱导细胞发生G0/G1期阻滞,从而抑制MDCC-MSB1增殖,且抑制率具有剂量依赖性。2倒置显微镜下观察MDCC-MSB1细胞生长情况,HE染色、AO/EB双荧光染色、透射电镜观察不同浓度下LaCl3诱导MDCC-MSB1细胞凋亡的形态学变化,流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸（PS）,结果表明LaCl3可诱导MDCC-MSB1细胞凋亡,且凋亡率具有剂量依赖性。3应用琼脂糖凝胶电泳、碱性SCGE、TUNEL法检测LaCl3对MDCC-MSB1细胞DNA的损伤作用,结果证实LaCl3通过引起MDCC-MSB1细胞[Ca2+]i增加,激活内源性核酸内切酶导致DNA在核小体间断裂途径诱导细胞凋亡。4通过对细胞内抗氧化功能的检测,表明LaCl3能够诱导MDCC-MSB1细胞NOS活性与NO含量升高,ROS含量增高,证实LaCl3能够破坏机体抗氧化防御系统及清除自由基的功能,使细胞发生氧化损伤,这可能是LaCl3诱导MDCC-MSB1细胞发生凋亡的机制之一。5应用Fura-2/AM荧光法检测[Ca2+]i,流式细胞术检测Δψm,比色法检测Caspase-3、Caspase-9活性,RT-PCR方法检测caspase-3 mRNA表达水平。结果表明LaCl3可导致MDCC-MSB1细胞Δψm下降,Caspase-3、Caspase-9活性上升,Caspase-3 mRNA表达增加,证实LaCl3通过激活Caspase通路导致MDCC-MSB1细胞凋亡。LaCl3能抑制MDCC-MSB1细胞的生长并诱导其凋亡。高浓度LaCl3可明显抑制肿瘤细胞生长,低浓度LaCl3对肿瘤细胞的生长无明显抑制作用,其抑制作用随LaCl3浓度的增加而增强。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1. 前言
  • 1.1 稀土元素的生物医学活性
  • 1.2 稀土元素与肿瘤细胞凋亡
  • 2+与钙调蛋白的影响'>1.2.1 稀土元素对Ca2+与钙调蛋白的影响
  • 1.2.2 稀土元素对核酸内切酶的影响
  • 1.2.3 稀土对细胞周期的影响
  • 1.2.4 稀土元素对线粒体的影响
  • 1.3 试验的目的与意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 主要仪器与材料
  • 2.1.1 主要仪器
  • 2.1.2 主要试剂
  • 2.1.3 试验药品及细胞株
  • 2.2 MDCC-MSB1 细胞培养及处理
  • 2.3 检测项目与方法
  • 3对MDCC-MSB1 细胞活性影响的检测'>2.3.1 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞活性影响的检测
  • 2.3.2 流式细胞术检测细胞周期
  • 3对MDCC-MSB1 细胞细胞凋亡的形态学观察'>2.3.3 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞细胞凋亡的形态学观察
  • 2.3.4 流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸（PS 外翻）
  • 2.3.5 MDCC-MSB1 细胞DNA 损伤的检测
  • 3对MDCC-MSB1 细胞氧化损伤的检测'>2.3.6 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞氧化损伤的检测
  • 2+]i 浓度影响的检测'>2.3.7 MDCC-MSB1 细胞[Ca2+]i 浓度影响的检测
  • 2.3.8 流式细胞术检测细胞线粒体膜电位（Δψm）
  • 2.3.9 Caspase-3、Caspase-9 蛋白活性的检测
  • 2.3.10 半定量RT-PCR 法测定MDCC-MSB1 细胞内CaM、Caspase-3 mRNA的表达
  • 2.4 实验数据分析与统计
  • 3. 结果与分析
  • 3对MDCC-MSB1 细胞活性影响的检测结果'>3.1 LACL3对MDCC-MSB1 细胞活性影响的检测结果
  • 3.1.1 MTT 比色法检测结果
  • 3.1.2 LDH 活性的检测结果
  • 3对MDCC-MSB1 细胞周期影响的检测结果'>3.1.3 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞周期影响的检测结果
  • 3诱导MDCC-MSB1 细胞凋亡的形态学检测结果'>3.2 LACL3诱导MDCC-MSB1 细胞凋亡的形态学检测结果
  • 3作用MDCC-MSB1 细胞24h 后的形态学观察'>3.2.1 不同浓度LaCl3作用MDCC-MSB1 细胞24h 后的形态学观察
  • 3.2.2 HE 染色观察结果
  • 3.2.3 AO/EB 双荧光染色检测结果
  • 3.2.4 电镜观察结果
  • 3对MDCC-MSB1 细胞磷脂酰丝氨酸外翻的检测结果'>3.3 LACL3对MDCC-MSB1 细胞磷脂酰丝氨酸外翻的检测结果
  • 3致MDCC-MSB1 细胞DNA 损伤的检测结果'>3.4 LACL3致MDCC-MSB1 细胞DNA 损伤的检测结果
  • 3.4.1 DNA Ladder 检测结果
  • 3.4.2 碱性SCGE 检测结果
  • 3.4.3 TUNEL 的检测结果
  • 3诱导MDCC-MSB1 细胞凋亡的氧化损伤检测结果'>3.5 LACL3诱导MDCC-MSB1 细胞凋亡的氧化损伤检测结果
  • 3.5.1 MDCC-MSB1 细胞内NOS 活性及NO 含量的检测结果
  • 3.5.2 MDCC-MSB1 细胞内ROS 含量的检测结果
  • 3对MDCC-MSB1 细胞[Ca2+]I 影响的检测结果'>3.6 LACL3对MDCC-MSB1 细胞[Ca2+]I 影响的检测结果
  • 3对肿瘤细胞ΔΨM 变化的检测结果'>3.7 LACL3对肿瘤细胞ΔΨM 变化的检测结果
  • 3对肿瘤细胞CASPASE-3、CASPASE-9活性影响的检测结果'>3.8 LACL3对肿瘤细胞CASPASE-3、CASPASE-9活性影响的检测结果
  • 3对MDCC-MSB1 细胞内CAM、CASPASE-3MRNA 的表达的影响'>3.9 LACL3对MDCC-MSB1 细胞内CAM、CASPASE-3MRNA 的表达的影响
  • 3对MDCC-MSB1 细胞内β-actin、CaM 与Caspase-3 基因片断 PCR产物的鉴定结果'>3.9.1 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞内β-actin、CaM 与Caspase-3 基因片断 PCR产物的鉴定结果
  • 3.9.2 最佳PCR 反应条件的摸索结果
  • 3对MDCC-MSB1 细胞内Caspase-3、CaMmRNA 表达的检测结果'>3.9.3 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞内Caspase-3、CaMmRNA 表达的检测结果
  • 4. 讨论
  • 3对MDCC-MSB1 细胞增殖抑制作用研究'>4.1 LACL3对MDCC-MSB1 细胞增殖抑制作用研究
  • 3对细胞增殖抑制率的影响'>4.1.1 MTT 法检测LaCl3对细胞增殖抑制率的影响
  • 3对MDCC-MSB1 细胞培养上清液中LDH 活性的影响'>4.1.2 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞培养上清液中LDH 活性的影响
  • 3对MDCC-MSB1 细胞周期抑制的影响'>4.1.3 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞周期抑制的影响
  • 3对MDCC-MSB1 细胞CAMMRNA 表达的影响'>4.2 LACL3对MDCC-MSB1 细胞CAMMRNA 表达的影响
  • 3诱导MDCC-MSB1 细胞促凋亡作用的研究'>4.3 LACL3诱导MDCC-MSB1 细胞促凋亡作用的研究
  • 3对MDCC-MSB1 细胞的形态和结构的影响'>4.3.1 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞的形态和结构的影响
  • 3对MDCC-MSB1 细胞膜结构的影响'>4.3.2 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞膜结构的影响
  • 3对MDCC-MSB1 细胞DNA 损伤的影响'>4.3.3 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞DNA 损伤的影响
  • 3诱导MDCC-MSB1 细胞发生氧化应激的研究'>4.4 LACL3诱导MDCC-MSB1 细胞发生氧化应激的研究
  • 3对MDCC-MSB1 细胞中NOS 活性及NO 含量变化的影响'>4.4.1 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞中NOS 活性及NO 含量变化的影响
  • 3对MDCC-MSB1 细胞内ROS 含量变化的影响'>4.4.2 LaCl3对MDCC-MSB1 细胞内ROS 含量变化的影响
  • 3对MDCC-MSB1 细胞[Ca2+]I 的影响'>4.5 LACL3对MDCC-MSB1 细胞[Ca2+]I 的影响
  • 3诱导MDCC-MSB1 细胞内线粒体膜电位改变的影响'>4.6 LACL3诱导MDCC-MSB1 细胞内线粒体膜电位改变的影响
  • 3对CASPASE-3MRNA 表达及CASPASE-3、9 蛋白活性的影响'>4.7 LACL3对CASPASE-3MRNA 表达及CASPASE-3、9 蛋白活性的影响
  • 5. 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文

    • 相关论文文献

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