小分子化合物bis-N-norgliovictin调控TLR4信号通路的研究

论文摘要

Toll样受体（Toll like receptors, TLRs）在哺乳动物的免疫系统中发挥着会重要作用。它们识别不同的微生物进而激活天然免疫和获得性免疫系统,控制机体的免疫反应。其中TLR4介导的免疫反应的异常活化与许多难治性疾病（如：肿瘤、病毒感染、自身免疫病等）的发生发展密切相关,而临床上针对这一通路的治疗药物非常有限。因此,发现新的调控TLR4信号通路的小分子化合物,并深入研究其调控特点与机制,将有可能开发出新的药物,为这些疾病的治疗带来新的希望。脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）是TLR4最典型的配体,能激活TLR4信号通路,产生大量炎性因子。于是我们建立了LPS诱导的小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7模型,通过流式细胞术胞内因子检测的方法,从一系列海洋来源的共生菌产物中筛选能抑制该模型肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）产生的小分子化合物。我们筛选出几个化合物能抑制TNF-α和MCP-1的表达,其中化合物bis-N-norgliovictin（来自海洋真菌的二酮哌嗪类化合物）效果最明显。基于此,我们对bis-N-norgliovictin抗炎作用的特点和机制进行了进一步探索。首先,我们用CCK-8试剂检测细胞活力,发现bis-N-norgliovictin （0.5～16μg/ml）对RAW264.7细胞的活力无影响,说明bis-N-norgliovictin的抗炎作用与其细胞毒性无关；接着,用ELISA或流式细胞术分析不同浓度bis-N-norgliovictin （0.5、1、2μg/ml）对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-β产生的影响。结果显示,bis-N-norgliovictin对这些炎性因子均有不同程度的抑制作用；荧光定量PCR分析结果表明,bis-N-norgliovictin剂量依赖性地抑制炎性炎性因子mRNA的表达水平；同时,我们还发现bis-N-norgliovictin对小鼠腹腔巨噬细胞和LPS诱导的小鼠炎症模型具有类似的抗炎作用。流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞对FITC-LPS的结合和内吞能力,发现bis-N-norgliovictin （0.5、2μg/ml）对其并无影响,说明,bis-N-norgliovictin不改变巨噬细胞的信号识别和吞噬功能。TLR4诱导两条不同的信号通路,分别由MyD88和TRIF来介导。其中MyD88依赖的信号通路主要经过MAPKs和NF-κB,最终产生致炎因子（如TNF-α、IL-6）; TRIF依赖的信号通路除上述MAPKs和NF-κB外,还经过干扰素调节因子3（IRF3）,最终产生Ⅰ型干扰素和干扰素诱导基因（如IFN-β、IP-10）。上述实验结果已表明,bis-N-norgliovictin对MyD88和TRIF依赖的两条通路的产物都有抑制作用,这就提示我们,该化合物可能对这两条通路都起调控作用。接下来我们从这两条通路出发研究bis-N-norgliovictin的作用机制。用Western Blot法分析RAW264.7细胞NF-κB上游IκBα的磷酸化水平和降解情况,结果显示,bis-N-norgliovictin （2μg/ml）能显著下调LPS诱导的IκBα的磷酸化和降解水平；免疫荧光法观察到bis-N-norgliovictin减少LPS诱导的NF-κB的入核；同时,bis-N-norgliovictin能显著抑制LPS诱导的MAPKs中JNK和p38的磷酸化,而对ERK的磷酸化几乎不影响；荧光报告基因检测发现,bis-N-norgliovictin降低LPS诱导的AP-1的活性；另一方面,bis-N-norgliovictin对LPS诱导的RAW264.7细胞IRF3的磷酸化也起一定的抑制作用。综上所述,筛选出的小分子化合物bis-N-norgliovictin能有效抑制TLR4介导的巨噬细胞炎症通路的活化,对TLR4通路中MyD88和TRIF两条途径均有下调作用。所有结果提示,bis-N-norgliovictin是一个新的TLR4通路的小分子抑制剂,它有可能成为治疗TLR4相关疾病的候选化合物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词表
• 前言
• 第一章 TLR4信号通路研究进展
• 1.1 LPS-TLR4信号通路
• 1.1.1 MyD88依赖的信号通路
• 1.1.2 TRIF依赖的信号通路
• 1.2 TLR4通路抑制剂研究进展
• 1.2.1 TLR4信号通路的内源性抑制剂
• 1.2.2 TLR4信号通路的外源性抑制剂
• 第二章 基于TLR4通路的小分子化合物的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验对象
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器和设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 小分子化合物溶液配置
• 2.3.2 细胞培养
• 2.3.3 流式细胞术检测胞内细胞因子水平
• 2.3.4 数据统计分析
• 2.4 实验结果与分析
• 2.4.1 LPS对RAW264.7细胞形态及炎性因子产生的影响
• 2.4.2 小分子化合物筛选结果
• 2.5 讨论
• 第三章 Bis-N-norgliovictin抑制LPS诱导的炎性因子的产生
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验对象
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 CCK-8法检测细胞活力
• 3.3.2 小鼠腹腔巨噬细胞的获取与鉴定
• 3.3.3 ELISA法或流式细胞术检测炎性因子蛋白水平
• 3.3.4 荧光定量PCR分析炎性因子mRNA水平
• 3.3.5 在体实验
• 3.3.6 数据统计分析
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 Bis-N-norgliovictin不影响巨噬细胞的细胞活力
• 3.4.2 Bis-N-norgliovictin抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎性因子的产生
• 3.4.3 Bis-N-norgliovictin抑制LPS诱导的炎性因子mRNA水平
• 3.4.4 Bis-N-norgliovictin抑制LPS诱导的腹腔巨噬细胞炎性因子的产生
• 3.4.5 Bis-N-norgliovictin抑制LPS诱导的小鼠血清炎性因子水平
• 3.5 讨论
• 第四章 Bis-N-norgliovictin对TLR4信号通路的调控作用
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 实验对象
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 流式细胞术检测细胞对FITC-LPS的结合与内吞
• 4.3.2 Western bolt
• 4.3.3 免疫荧光法观察NF-κB核转位
• 4.3.4 质粒提取
• 4.3.5 质粒转染
• 4.3.6 荧光报告基因检测
• 4.3.7 数据统计分析
• 4.4 实验结果与分析
• 4.4.1 Bis-N-norgliovictin不影响LPS的结合与内吞
• 4.4.2 Bis-N-norgliovictin抑制NF-κB信号通路
• 4.4.3 Bis-N-norgliovictin选择性抑制MAPK信号通路
• 4.4.4 Bis-N-norgliovictin抑制IRF3信号通路
• 4.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 硕士期间科研成果
• 致谢