水基磁流体联合融合蛋白RGD-tTF双靶向诱发肿瘤组织血管栓塞

论文摘要

利用靶向性血栓药物实现对实体瘤血管的选择性栓塞是一种新颖的抗肿瘤策略。该策略以截短的组织因子（truncated Tissue Factor,tTF;也称前凝血因子）为效应因子,结合肿瘤血管靶向载体实现选择性诱发肿瘤组织血管栓塞,阻断肿瘤营养物质和氧气的供给,引发肿瘤缺血性坏死,达到抗肿瘤作用。目前的研究多采用单载体结合单效应因子的形式,存在着载体结合力不足（单价结合）、载体药物负荷低、效应因子在靶位富集速度慢和浓度不足等问题,其疗效并不理想。为克服上述问题和提高该策略的抗肿瘤效果,本文首次利用水基磁流体为基体制备新型的纳米磁控血栓药物,以获得药物载体的多价结合、高容量携带、双靶向（载体生物靶向与水基磁流体的磁性物理靶向）治疗等特性。为验证该设想的可行性,我们以FeCl3·6H2O为铁源,NaOH为碱,利用改良后的化学共沉淀法制备MnFe2O4粒子,在制备过程中加入乙酸和表面活性剂柠檬酸修饰MnFe2O4粒子,制得以PBS为载液的MnFe2O4水基磁流体;利用H-600透射电镜观测其纳米粒径,以超导量子干涉磁强仪（SQUID）鉴定磁性,并以MTT和LDH比色法检测其细胞毒性;将RGD-tTF融合蛋白与水基磁流体结合后,通过一系列体外实验检测结合后RGD-tTF的整体活性;并在小鼠肿瘤模型中检测RGD-tTF水基磁流体（RGD-tTF-MnFe2O4）的靶向定位及肿瘤血管栓塞效果。结果表明,成功制备出的纳米粒子呈椭圆或圆形,粒径尺寸集中在10-25 nm之间,呈超顺磁性并具磁流变现象,且该水基磁流体能稳定保存;凝血实验和凝血因子X（F X）活化实验证实本室重组的RGD-tTF融合蛋白与磁流体结合后仍保留tTF部分活化FX,引发血液凝固的的活性;流式细胞仪检测表明,与磁流体的结合对RGD-tTF在内皮细胞表面结合率无明显影响,并证实在磁场的作用下能实现水基磁流体对RGD-tTF的体外细胞定位作用。在小鼠肝癌H22模型的体内实验中,组织学观察发现RGD-tTF-MnFe2O4和单纯的RGD-tTF均能选择性定位于肿瘤组织,并特异性诱发肿瘤组织血管栓塞,导致肿瘤细胞坏死,而对正常组织无毒副作用,且在外加磁场的作用下,RGD-tTF-MnFe2O4在靶位上的快速富集并高效促发外源性凝血通路,对肿瘤组织的定位效果和栓塞程度均优于单纯的RGD-tTF。总之,通过纳米技术成功构建的RGD-tTF水基磁流体具有载体生物导向与水基磁流体磁性定位的双重定位功能,能更有效地选择性诱发肿瘤组织血管栓塞、抑制肿瘤生长,这为肿瘤血管靶向治疗提供新的药物制剂奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 磁学基本知识
• 1.1 磁性的分类
• 1.1.1 抗磁性
• 1.1.2 顺磁性
• 1.1.3 反铁磁性
• 1.1.4 铁磁性
• 1.1.5 亚铁磁性
• 1.2 磁畴及磁滞回线
• 2 磁流体的组成
• 2.1 磁性纳米颗粒
• 2.2 基液
• 2.3 表面活性剂（稳定剂）
• 3 磁流体的制备方法
• 3.1 机械研磨法
• 3.2 真空蒸镀法
• 3.3 热分解法
• 3.4 化学沉淀法
• 3.5 氢还原法
• 3.6 电沉积法
• 3.7 火花电蚀法
• 3.8 等离子体CVD法
• 3.9 阴离子交换树脂法
• 3.10 紫外线分解法
• 4 化学共沉淀法制备水基磁流体
• 4.1 直接包覆法
• 4.2 二次包覆法
• 4.3 其它包覆法
• 5 磁流体的特点
• 6 目前存在的问题
• 6.1 超微磁性颗粒的稳定性
• 6.2 表面活性剂的适应特性
• 6.3 载液特性的局限性
• 6.4 聚集作用的影响
• 7 磁流体在肿瘤学治疗领域的应用进展
• 7.1 磁流体热疗
• 7.1.1 磁流体局部热疗
• 7.1.2 磁流体全身热疗
• 7.1.3 磁流体细胞内热疗
• 7.1.4 肿瘤热疗的自动控温、恒温
• 7.2 细胞分离
• 7.3 磁共振成像的造影剂
• 7.4 磁栓塞治疗
• 7.5 药物靶向
• 7.6 磁场对肿瘤的抑制作用
• 8 肿瘤血管靶向治疗
• 8.1 肿瘤组织血管选择性栓塞的研究进展
• 9 本研究的目的和内容
• 第一章 RGD-tTF水基磁流体的制备及其体外活性鉴定
• 一、材料和方法
• 1 材料
• 1.1 菌株、质粒及细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器及设备
• 1.4 主要溶液的配制
• 1.5 缩略词表
• 2 方法
• 2.1 水基磁流体的制备
• 2O₄粒子的原理'>2.1.1 化学共沉淀生成MnFe₂O₄粒子的原理
• 2.1.2 与融合蛋白结合
• 2.2 样品的性能表征
• 2.2.1 样品的形貌和粒径
• 2.2.2 样品的磁性能
• 2.3 生物兼容性检测
• 2.3.1 MTT比色分析法
• 2.3.2 乳糖脱氢酶比色法
• 2.4 结合后tTF部分的相关活性
• 2.4.1 一步法测定tTF的促凝血活性
• 2.4.2 FX活化实验
• 2.5 结合后RGD部分的相关活性
• 2.5.1 细胞培养
• 2.5.2 药物的准备
• 2.5.3 融合蛋白的荧光标记
• 2.5.4 共聚焦扫描显微镜检测
• 2.5.5 流式细胞术
• 2O₄在内皮细胞分布的影响'>2.5.6 磁场对RGD-tTF-MnFe₂O₄在内皮细胞分布的影响
• 二、结果与分析
• 1 磁流体的表征
• 1.1 透射电子显微镜（TEM）分析
• 1.2 磁性表征
• 1.3 磁响应性和稳定性检测
• 1.4 表面活性剂柠檬酸的影响
• 1.5 无水乙醇的作用
• 2 磁流体生物兼容性检测
• 2.1 MTT比色分析法
• 2.2 乳糖脱氢酶比色法
• 3 结合后tTF部分的相关活性
• 3.1 一步法凝血实验
• 3.2 FX活化实验
• 4 结合后RGD部分的相关活性
• 4.1 共聚焦显微镜照片
• 4.2 流式细胞仪检测结果
• 2O₄在内皮细胞分布的影响'>4.3 磁场对RGD-tTF-MnFe₂O₄在内皮细胞分布的影响
• 三、讨论
• 第二章 肿瘤动物模型的建立和病理学分析
• 一、材料和方法
• 1 材料
• 1.1 细胞株和实验小鼠
• 1.2 主要试剂及耗材
• 1.3 主要仪器及设备
• 1.4 主要溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 肿瘤动物模型的建立
• 2.1.1 肿瘤的移植
• 2.1.2 药物的准备
• 2.1.3 玻片的清洗与涂片
• 2.2 肿瘤动物模型的荧光定位
• 2.2.1 给药
• 2.2.2 肿瘤组织冷冻切片的制备
• 2.2.3 切片荧光定位实验
• 2.2.4 HOECHST 33258复染
• 2.3 病理学观察
• 2.3.1 HE染色
• 二、结果与分析
• 1 切片荧光定位实验
• 2 融合蛋白在肿瘤组织的定位
• 3 病理学观察
• 三、讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢