纳米聚合物PAMAM-D在猪精子介导转基因中的应用研究

论文摘要

为优化猪精子介导转基因（SMGT）技术,提高转基因效率,开展了以下研究：（1）将纳米化聚酰胺-胺型树枝状聚合物（PAMAM-D）应用于猪精子转染pEGFP基因,经原位杂交检测精子阳性率,体外受精（IVF）分析pEGFP基因的表达。结果表明：0.5μg线状pEGFP质粒DNA中按质量比PAMAM-D:DNA为20：1加入PAMAM-D时精子阳性率最高（P<0.05）；孵育时间为90和120min时,精子阳性率显著高于30和60min组（P<0.05）；以此最优条件处理精子,精子阳性率显著高于未处理组和脂质体处理组（23.93%±2.60%vs7.25%±2.04%,13.25%±2.15%；P<0.05）。各处理组精子经IVF后,PAMAM-D组pEGFP表达率显著高于其他两组（9.19%±1.43%vs4.81%±1.35%,3.43%±1.05%；P<0.05）,各组表达GFP的胚胎经基因组PCR分析均能检测到pEGFP基因。（2）将PAMAM-D处理的冻融猪精子进行卵胞质内单精子注射,探索PAMAM-D处理猪冻融精子和不同化学激活方法对SMGT-ICSI胚胎体外发育和pEGFP基因表达的影响。结果表明：PAMAM-D处理精子与对照组相比,显著提高SMGT-ICSI生产胚胎中pEGFP的表达率（25.83%±2.31%vs17.5%±1.80%；P<0.05）,采用1.0kV/cm,30μs,1DC为电激活参数并联合2Io+DMAP为化学激活剂时pEGFP基因表达率最高。（3）植酸酶基因重构质粒经线性化处理后与去除精浆的猪新鲜精液17℃共孵育,通过人工授精对6头受体母猪进行配种。结果表明：4头受体母猪受孕,产仔38头；从仔猪耳基因组中PCR扩增植酸酶基因,有6头PCR结果为阳性,转基因阳性率为15.8%（6/38）。综上所述：PAMAM-D可有效介导猪精子转染外源DNA,并通过体外受精将外源基因导入胚胎中；PAMAM-D处理精子提高SMGT-ICSI胚胎中外源基因的表达率；另外,利用精子介导转基因技术将目的基因成功转入阳性个体体内,获得植酸酶转基因阳性猪,本研究为家畜的转基因研究提供了理论与实践参考。

论文目录

• 本论文由国家转基因生物新品种培育重大专项资助
• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 1 文献综述
• 1.1 精子介导转基因的研究进展
• 1.1.2 SMGT的机理
• 1.1.3 SMGT的主要环节及影响因素
• 1.1.4 SMGT的改进方法
• 1.1.5 SMGT获得转基因动物的繁殖技术
• 1.2 卵胞质内单精子注射的研究进展
• 1.3 SMGT-ICSI的主要环节
• 1.3.1 卵母细胞的收集和处理
• 1.3.2 精子的准备
• 1.3.3 精子的显微注射
• 1.3.4 ICSI后胚胎的激活
• 1.3.5 ICSI后胚胎的培养
• 1.4 影响SMGT-ICSI的主要因素
• 1.4.1 精子获能与顶体反应
• 1.4.2 精子新鲜与死活
• 1.4.3 精子不同发生阶段
• 1.4.4 精子预处理
• 1.4.5 ICSI后卵的激活方法
• 1.5 本研究的背景、目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 试验试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 卵母细胞的收集、体外成熟及卵丘细胞的去除
• 2.2.2 纳米化PAMAM-D介导精子转染
• 2.2.3 转染精子的原位杂交检测
• 2.2.4 纳米化PAMAM-D介导后转染精子的IVF
• 2.2.5 体外受精胚胎基因组的PCR分析
• 2.2.6 纳米化PAMAM-D介导后转染精子ICSI
• 2.2.7 SMGT-ICSI后卵母细胞激活
• 2.2.8 SMGT-AI制备植酸酶转基因猪
• 2.2.9 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 纳米化PAMAM-D介导猪精子转染外源DNA的条件的优化
• 3.1.1 不同PAMAM-D和外源DNA剂量配伍对猪精子转染外源DNA效率的影响
• 3.1.2 不同孵育温度和时间对猪精子转染外源DNA效率的影响
• 3.1.3 比较PAMAM-D和脂质体对猪精子转染外源DNA效率的影响
• 3.1.4 不同DNA剂量、孵育温度和时间对精子活力的影响
• 3.2 不同载体处理猪精子对EGFP基因在体外受精胚胎中表达的影响
• 3.3 SMGT-卵胞质内单精子注射技术生产转基因猪
• 3.3.1 卵母细胞的体外成熟
• 3.3.2 冻融处理精子对SMGT-ICSI胚胎体外发育和EGFP基因表达的影响
• 3.3.3 PAMAM-D和脂质体处理冻融精子对SMGT-ICSI胚胎体外发育和EGFP基因表达的影响
• 3.3.4 电激活对SMGT-ICSI胚胎体外发育和EGFP基因表达的影响
• 3.3.5 不同化学激活方法对SMGT-ICSI胚胎体外发育和EGFP表达的影响
• 3.3.6 不同时间间隔的激活处理对SMGT-ICSI胚胎体外发育和EGFP表达的影响
• 3.4 SMGT-人工授精技术生产植酸酶转基因猪
• 4 讨论
• 4.1 PAMAM-D介导猪精子转染外源DNA条件的优化
• 4.2 PAMAM-D和脂质体对猪精子转染外源DNA效率的影响
• 4.3 激活处理对SMGT-ICSI胚胎体外发育和EGFP基因表达的影响
• 4.4 SMGT-人工授精技术生产植酸酶转基因猪
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文