对虾白斑综合症病毒的一种结合蛋白BP53的表达与功能研究

论文摘要

对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus,WSSV）自1992年首次暴发以来对全球虾类养殖业造成严重危害,是广受关注的甲壳类病毒新种（Whispovirus）。各国相关研究的焦点逐渐转移到WSSV蛋白质组学方向,希望能够找到预防和治疗白斑病的有效途径和技术手段。我们从定位参与WSSV感染的关键性的粘附蛋白或受体蛋白分子入手,进而利用RNAi、抗体阻断、竞争性抑制物、小分子药效团的开发等基因工程、转录工程、蛋白质工程以及新近的代谢工程技术来实现防治WSSV的感染。本实验室长期从事WSSV-VP37的功能研究,已证实它为WSSV的一个主要的粘附蛋白。通过Ni2+亲和层析法和VOPBA （Virus Overlay Protein Binding Assay）技术分离到一个与WSSV-VP37有相互作用的宿主结合蛋白（binding protein,BP53）,MALDI-TOF MS鉴定结果表明该蛋白质和F1F0-ATP synthaseβsubunit具有较高的匹配率,通过同源克隆得到凡纳滨对虾F1F0-ATP synthaseβsubunit的部分cDNA序列。本论文就是以此为基础开展的。本研究主要包括3部分内容:以原核表达的BP53-12.7蛋白为抗原制备多克隆抗体,采用免疫荧光和胶体金技术对BP53蛋白进行组织学定位,并通过感染中和实验验证其活性;凡纳滨对虾bp53基因在WSSV感染前后的时空性差异表达分析;3种WSSV敏感宿主ATP synthaseβsubunit基因全长的克隆及其系统树比对分析。本论文取得的主要研究结果如下:对同源克隆获得的部分bp53基因进行生物信息学分析,选取其中抗原性比较高的区段进行大肠杆菌TOP10原核表达,并进行了条件优化发酵。发酵产物的Tricine-SDS-PAGE和Western-blot分析表明重组蛋白是以包涵体的状态存在的,分子量经GEL-PRO软件分析约为12.7KDa,在L-阿拉伯糖终浓度为0.02%,温度为37℃时表达量最大,同时Western-blot免疫印迹证实重组蛋白BP53-12.7与DIG-WSSV有结合活性。Tricine-SDS-PAGE大量制备重组蛋白BP53-12.7,经Western-blot鉴定后作为抗原直接免疫新西兰大白兔来制备抗BP53-12.7的多克隆抗体。制备的抗血清经菌体吸附法和硫酸铵沉淀法纯化以去除杂抗体分子,Western-blot和ELISA法检测抗体的特异性和效价。结果表明抗BP53-12.7多克隆抗体能特异性的识别rBP53-12.7,且效价测定结果为1:6400。多抗的制备对于后续的BP53-12.7蛋白的定位研究以及应用于中和实验都有重要的价值,目前WSSV-VP37结合蛋白BP53的定位研究现在正在进行。分别选用（ RNA PolymeraseⅡ） RPⅡ和β-actin作为内参基因, SYBR-GreenⅠReal-time PCR分析了BP53基因在凡纳滨对虾体内的组织特异性表达,结果分析采用溶解曲线法和??CT相对定量法。表达分析结果表明,结合蛋白BP53基因在鳃组织和肝胰腺组织中表达水平较高,而在血淋巴和甲壳下上皮组织中的表达水平存在差异,不同的内参基因得到了不同的结果;证实了实验中设立多个内参基因有助于降低实验系统误差的必要性。目前WSSV感染后BP53基因的时空性表达分析正在进行。改进了简并引物设计方法,并应用于同源克隆结合RACE技术扩增中国对虾、日本对虾、克氏原鳌虾的ATP合成酶β亚基的基因全长。目前中国对虾已经得到cDNA全长1822bp,日本对虾和克氏原鳌虾分别得到部分全长分别为1758bp和1369bp。对甲壳动物虾类中中国对虾、日本对虾、凡纳滨对虾、克氏原鳌虾、太平洋鳌虾ATP合成酶β亚基的基因进行序列分析,结果表明它们的差别主要集中在3’UTR的长度,其它的元件如TATA-box、E-box、N端线粒体定位信号、AATAA加尾信号以及编码的525个氨基酸都基本相同。对五种虾与其它WSSV不敏感物种ATP synthaseβsubunit的序列分析和分子进化树分析表明,该基因在种内进化上相对保守;五种甲壳动物虾类聚成不同于其它被选物种的一支,序列差异主要表现在N-端和C-端,且在C-端存在4个蛋白激酶磷酸化位点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 受体蛋白模建及其自我调节机制在疾病防治中的应用
• 1.1 受体蛋白结构的计算机模建及其相应的药物设计思路
• 1.1.1 受体蛋白结构的计算机模建
• 1.1.2 基于受体结构的药物设计思路
• 1.2 受体的自我调节及其相应的疾病防治手段
• 1.2.1 受体的自我调节
• 1.2.2 基于受体自我调节机制的疾病防治手段
• 1.2.2.1 DNA 水平的阻滞途径
• 1.2.2.2 RNA 水平的阻滞途径
• 1.2.2.3 蛋白质水平的阻滞手段
• 1.3 展望
• 2 质膜异位 F1F0 -ATP synthase 研究进展
• 2.1 异位F1F0 -ATP synthase 的发现及其可能的异位机制
• 2.2 异位F1F0 -ATP synthase 作为受体参与的一些生物学现象
• 2.2.1 脂质代谢
• 2.2.2 耦合因子6（Coupling Factor 6）
• 2.2.3 血管生成抑制素（angiostatin）
• 2.2.4 HSP60\90（Heat-Shock Protein 60\90）
• 2.2.5 WSSV-AP（white spot syndrome virus attachment protein）
• 2.3 展望
• 第二章 WSSV 结合蛋白 BP53（Binding Protein 53）部分抗原区段的原核表达，鉴定及其活性分析
• 1 WSSV 结合蛋白 BP53 的生物信息学初步分析及表达区段的确定
• -12.7基因原核表达载体的构建'>2 bp53^-12.7基因原核表达载体的构建
• 3 阳性目的单克隆的诱导表达与鉴定
• 4 结果
• 4.1 重组蛋白的生物信息学初步分析
• 4.2 引物设计
• -12.7的制备'>4.3 质粒与目的片段bp53^-12.7的制备
• 4.4 重组克隆的质粒提取
• 4.5 重组克隆的双酶切鉴定、PCR 检测与DNA 测序
• 4.6 L-ara 梯度诱导重组表达与电泳分析
• 4.7 温度梯度诱导重组表达
• -12.7的免疫印迹检测'>4.8 目的重组蛋白BP53^-12.7的免疫印迹检测
• -12.7的结合活性验证'>4.9 目的重组蛋白BP53^-12.7的结合活性验证
• 5 讨论
• -12.7多克隆抗体的制备与评价'>第三章 WSSV 结合蛋白rBP53^-12.7多克隆抗体的制备与评价
• 1 试剂与仪器
• 2 方法
• -12.7的制备'>2.1 抗原rBP53^-12.7的制备
• 2.2 免疫途径与过程
• 2.3 抗血清的纯化
• 2.4 纯化后血清的特异性鉴定—Western-blot 印迹法
• 2.5 纯化后血清的效价测定—ELISA 法
• 3 结果
• 3.1 纯化的抗血清的ELISA 检测
• 3.2 抗血清特异性的Western-blot 检测
• 3.3 抗血清效价的ELISA 法测定
• 4 讨论
• 第四章 凡纳滨对虾中 BP53 基因的组织特异性表达分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 内参序列搜索结果
• 2.2 引物设计
• 2.3 bp53 基因的组织特异性表达分析
• 2.3.1 bp53 与内参基因Real Time-PCR 扩增产物的溶解曲线分析
• 2.3.2 bp53 与内参基因的扩增效率对比
• 2.3.3 bp53 基因的组织特异性表达分析
• 3 讨论
• 第五章 三种 WSSV 敏感宿主 ATP synthase βsubunit 基因的克隆与分析
• 1 3 种 WSSV 敏感宿主 ATP synthaseβsubunit 基因全长的克隆.
• 2 ATP synthase βsubunit 基因序列分析与系统树比对分析..
• 3 结果
• 3.1 序列信息
• 3.2 序列比对分析
• 3.3 改进的简并引物设计方法
• 3.4 3'和5' RACE 套式引物的设计
• 3.5 RNA 提取结果
• 3.6 简并引物扩增结果
• 3.7 3' RACE 扩增结果
• 3.8 5' RACE 扩增结果
• 3.9 五种虾的ATP synthase βsubunit 基因序列分析
• 3.10 虾类与其它物种ATP synthase βsubunit 序列的系统进化树分析
• 3.10.1 ATP synthase βsubunit 基因的系统进化树分析
• 3.10.2 ATP synthase βsubunit 蛋白质序列的进化树构建与分析
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表文章目录
• 致谢