N-酰基乙醇胺延缓香石竹切花（Dianthus caryophyllus L.）衰老机理的研究

论文摘要

揭示切花采后衰老机理，是观赏园艺学科应用基础的研究重点之一，也是采后保鲜技术的重要理论依据。N-酰基乙醇胺（N-acylethanolalnines，NAEs）作为细胞中微量的脂质组分，因其参与了植物细胞抗病防卫系统的信号转导，抑制参与膜磷脂降解以及信号转导网络中重要组分磷脂酶Dα的活性，正逐步引起人们的关注。Chapman等应用人工合成的NAEs配合其它保鲜剂处理香石竹、月季等切花，显著延长了其瓶插寿命，并就此申请了技术专利。但迄今国内外尚未有单组分NAEs延缓植物（包括观赏植物）衰老相关机理的研究报道。本课题是针对国内外NAEs的研究现状，从探讨单组分NAEs系列化合物对香石竹（Dianthus caryophyllus L.）、月季（Rose hybrida L.）等兼具科学研究及商业重要性的模式种及其不同品种的切花瓶插效应的影响入手，并进一步从膜结构与功能完整性角度，包括膜脂过氧化作用、酶性及非酶性抗氧化防护系统活性、膜系统主要组分及主要膜结合酶活性等生理指标，深入系统地探讨NAEs延缓切花衰老的相关机理，在充实园艺作物衰老理论以及拓展对NAEs认识的同时，也为将信号转导水平调控衰老的机理应用于采后化学保鲜技术提供全新思路。主要的研究结果如下：1筛选确定了NAEs的溶剂系统、对切花的适宜处理方式以及有效处理浓度。结果表明，以0.1％异丙醇+10mg／L Tween-20为溶剂系统，对香石竹‘Red Barbara’、‘Snow White’和月季‘Red Berlin’、‘Avalanche’进行N-月桂酰乙醇胺[N-lauroylethanolamine，NAE（12：0）]重复4h脉冲处理，能有效延长上述切花的瓶插寿命。在供试的NAE（12：0）浓度梯度中，延长上述切花瓶插寿命的最有效作用浓度因上述切花种和品种不同而异，依次分别为5、5～25、25及25～50μmol／LNAE（12：0）。研究了具有不同脂肪酰基碳链长度的NAEs系列化合物——N-月桂酰乙醇胺[N-lauroylethanolamine，NAE（12：0）]、N-肉豆蔻酰乙醇胺[N-myrisotlethanolamine，NAE（14：0）]、N-软脂酰乙醇胺[N-palmitoylethanolamine，NAE（16：0）]、N-硬脂酰乙醇胺[N-stearoylethanolamine，NAE（18：0）]对香石竹‘Red Barbara’切花的延衰有效程度。5μmol／L NAEs重复4h脉冲处理的瓶插试验结果表明，NAEs对香石竹‘Red Barbara’切花瓶插寿命的延长效应随脂肪酰基碳链长度的增加而下降，即NAE（12：0）＞NAE（14：0）＞NAE（16：0）＞NAE（18：0）。特别是研究揭示，NAE（12：0）重复脉冲处理延长香石竹‘Red Barbara’及‘Snow White’切花瓶插寿命的显著效应，在开花级数的3个时期中，无一例外地仅限于对开放期的延长，即上述两种香石竹切花的开放期持续时间分别较对照延长了2.3d、2.8d，且与对照表现出显著差异（p＜0.05），而对花朵开放前及初萎期持续时间没有影响，提示NAEs延缓切花衰老的专一性作用时段在花朵开放期。评价了将NAEs与常规保鲜剂对切花进行复合保鲜处理的应用前景。2进一步探讨了NAE（12：0）在香石竹‘Red Barbara’开放衰老进程中对膜脂过氧化和酶性及非酶性抗氧化防护系统的调节作用。以5μmol／L NAE（12：0）重复4h脉冲处理香石竹‘Red Barbafa’切花的研究结果表明：NAE（12：0）于切花开放后期至初萎发生前（瓶插第12d～14d）显著降低了花瓣离子渗漏率的上升趋势，阻滞了膜脂过氧化作用，如延缓了LOX活力的上升趋势，降低了膜脂过氧化产物MDA的累积速率，以及同一时期O2-及H2O2的产生速率；另一方面，有效上调了花瓣抗氧化酶，如SOD、CAT、APX和GR的活性以及抗氧化剂GSH、ASC及α-生育酚的水平。结果提示NAE（12：0）延缓切花衰老的调控机理涉及上调花瓣细胞抗氧化防护系统清除ROS能力，从而滞缓膜脂过氧化作用的发生。特别是再次证实，NAE（12：0）滞缓膜透性上升、滞后膜脂过氧化作用的发生以及上调抗氧化防护系统清除ROS的能力，同样显著有效的作用时段在切花开放后期至初萎发生前，即瓶插第12d～14d，与其延长‘Red Barbara’瓶插寿命的有效时段完全一致，体现了效果与作用机理的统一。3以5μmol／L NAE（12：0）重复4h脉冲处理香石竹‘Red Barbara’切花，从膜结构与功能角度系统研究阐明了NAE（12：0）的延袁实质，即在切花开放衰老的特定阶段保护了花瓣膜系统结构与功能的完整性。首先改进了花瓣微粒体膜、质膜及液泡膜的制备方法，分别采用分级离心及蔗糖密度梯度离心技术，高效、低成本的制备了上述膜系统；标志酶活性检测以及低pH值磷钨酸染色的电镜观察，证实获得的质膜微囊纯度很高，仅液泡微囊中混有极少量质膜。研究结果证实，NAE（12：0）调节着花朵开放衰老进程中花瓣膜系统组分及功能的如下相关参数变化：（1） NAE（12：0）处理于切花开放后期至初萎发生前（瓶插第12d～14d）延缓了微粒体膜磷脂、膜脂不饱和脂肪酸指数的下降以及长链脂肪酸在总脂肪酸中摩尔百分含量的上升，上述膜脂参数的改变与NAE（12：0）处理阻滞微粒体膜流动性下降的变化趋势完全吻合。（2）对微粒体膜蛋白含量和5种标志酶（钒酸盐敏感的ATPase、硝酸盐敏感的ATPase、细胞色素C氧化酶、细胞色素C还原酶、潜在二磷酸次黄嘌呤酶，它们分别是质膜、液泡膜、线粒体膜、内质网膜和高尔基体膜上的标志酶）比活力的分析显示，NAE（12：0）处理也能有效延缓切花开放后期至初萎发生前上述膜蛋白指标的下降速率。（3）瓶插8d后，NAE（12：0）处理组花瓣质膜、液泡膜中H+-ATPase、Ca2+-ATPase的活性均明显高于对照，提示NAE（12：0）处理后的切花，其花瓣能维持更高的细胞摄取溶质的能力，同时能更有效地维持胞内Ca2+稳态，从而能更长久地维持细胞生理代谢和信息传递功能的正常进行。综上数据表明，NAEs能通过延长切花的开放期、推迟其初萎的发生而延长切花的瓶插寿命，切花开放后期至初萎发生前是其发挥作用的关键生理时期。NAEs延缓切花衰老的调控机理涉及上调花瓣细胞抗氧化防护系统清除ROS能力、滞缓膜脂过氧化作用的发生，并参与了对微粒体膜脂组分的调节，由此延缓了花瓣微粒体膜流动性的下降速率，同时还能维持膜系统结合酶较高的活力，保护了细胞膜结构和功能的完整性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写符号及中英文对照表
• 第一章 文献综述
• 1 植物N-酰基乙醇胺（NAEs）的代谢机制及其生理功能
• 1.1 植物体中NAEs的种类及其分布
• 1.2 植物体中NAEs的代谢
• 1.3 NAEs在植物中的生理功能
• 2 园艺作物采后生理中的膜衰老
• 2.1 植物细胞膜的结构与组成
• 2.2 膜衰老时物化性质的变化
• 2.3 活性氧介导的膜衰老
• 3 本研究的目的、意义
• 参考文献
• 第二章 N-酰基乙醇胺对切花瓶插效应的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 NAEs溶剂系统筛选
• 2.2 NAE（12:0）不同处理方式对香石竹‘Red Barbara’切花瓶插效应的影响
• 2.3 NAEs系列化合物重复脉冲处理对香石竹‘Red Barbara’切花瓶插效应的影响
• 2.4 NAE（12:0）重复脉冲处理对香石竹‘Snow White’及月季‘Red Berlin’、‘Avalanche’切花瓶插效应的影响
• 2.5 NAE（12:0）重复脉冲处理对切花开放衰老进程萎蔫率及开花级数的影响
• 3 讨论
• 3.1 NAEs对切花瓶插效应的影响
• 3.2 NAEs重复脉冲处理延长切花瓶插寿命可能的作用靶标
• 参考文献
• 第三章 N-月桂酰乙醇胺对香石竹切花‘RED BARBARA’花瓣膜脂过氧化和抗氧化防护系统的调节
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’开放衰老进程中花瓣膜透性的影响
• 2.2 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’开放衰老进程中花瓣膜脂过氧化的阻滞作用
• 2^·-清除能力的调节'>2.3 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’开放衰老进程中花瓣O₂^·-清除能力的调节
• 2O₂清除能力的调节'>2.4 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’开放衰老进程中花瓣H₂O₂清除能力的调节
• 2.5 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’开放衰老进程中花瓣抗氧化剂含量的调节
• 2.6 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’开放衰老进程中花瓣GR活力及GSH含量的调节
• 3 讨论
• 3.1 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’开放衰老进程中花瓣膜透性和膜脂过氧化作用的调节
• 3.2 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’开放衰老进程中花瓣ROS产生及抗氧化防护系统能力的调节
• 参考文献
• 第四章 N-月桂酰乙醇胺对香石竹切花‘RED BARBARA’花瓣膜组分与功能的调节
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’花瓣微粒体膜组分的调节
• 2.2 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’花瓣微粒体膜功能的调节
• 2.3 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’花瓣质膜功能的调节
• 2.4 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’花瓣液泡膜功能的调节
• 3 讨论
• 3.1 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’花瓣微粒体膜组分与功能的调节
• 3.2 质膜与液泡膜的提取与分离
• 3.3 NAE（12:0）对香石竹切花‘Red Barbara’花瓣质膜、液泡膜功能的调节
• 参考文献
• 全文结论以及研究的创新点
• 攻读学位期间发表的与本研究相关的论文
• 致谢
• 附录