采用罗丹明123分离肝癌细胞系HepG2异质性亚群的鉴定

论文摘要

多种肿瘤均起源于已恶性转化的单个细胞,这种转化是由于基因突变的累积所致。肿瘤干细胞定义为:能分化出不同表型的,并能自我克隆产生子代致瘤性细胞的肿瘤细胞。它既可诱导肿瘤的发生,也可用于防治肿瘤。肿瘤干细胞与正常干细胞在许多方面具有相似之处,有研究发现急性髓细胞样白血病细胞中能分离出与骨髓造血干细胞具有相同干细胞表面标志的癌细胞,这些细胞能在免疫缺陷小鼠中诱导急性髓细胞样白血病的发生等等。肿瘤干细胞（ cancer stem cells,CSC ）是肿瘤的起始细胞这一观点已被广泛接受,目前已在多种恶性实体瘤中发现有肿瘤干细胞的存在,例如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌和脑肿瘤等中已发现了肿瘤干细胞。肝细胞癌是世界上男性最常见的恶性肿瘤之一,起病隐匿、发展迅速、恶性程度高。卵圆细胞起源于汇管区的胆管上皮,是肝脏干细胞的子代细胞,在经致癌剂或癌基因诱导分化后可形成肝细胞癌、胆管上皮细胞癌和未分化癌,卵圆细胞是宿主受致癌剂作用后发生肝癌的始动细胞。临床观察发现,肝癌细胞之间在耐药性上也有巨大的差异,这提示肝癌组织中可能存在有具有表型和功能特殊的肝癌细胞。分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机理、揭示肝癌复发和转移的机制具有重要的意义,并为治疗肝癌提供一个新的策略。罗丹名123（Rho123）结合流式细胞分选术（FCM）富集干细胞的基本原理是利用了干细胞对染料具有排斥性这一特异性功能标志,干细胞是通过细胞表面的P糖蛋白（P-gp）载体将进入胞内的荧光染料Rho123主动外泵至胞外,这些染色后的干细胞表现在流式细胞仪分析图上表现为低荧光的特征,将这些低荧光群分选即可达到富集和分离干细胞的目的,该方法首先在分离骨髓造血干细胞上获得了成功。目的:建立分离肝癌细胞系HepG2中对罗丹明123染料具有不同排斥能力细胞亚群的方法,并探讨其在肝癌异质性研究中的意义。方法:1、HepG2细胞Rho123染色的分选HepG2细胞常规消化,HBSS洗涤,制备成单细胞悬液,细胞密度为1×1010/ L。等分细胞悬液,两组均加入荧光染料Rho123,根据我们对MHCC97细胞系Rho123染色浓度选择终浓度为0.05mg/L,其中1组再加入维拉帕米,终浓度50mmol/L,37℃避光水浴30 min,冰上5 min终止染色,冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬。激发光源480 nm FCM分选,对数模式采集信号做一维散点图,将低Rho123且维拉帕米组缺失的区域设定为Rholow亚群的“门”,计算百分比,分选出Rholow及Rhohigh亚群。2、Rholow及Rhohigh亚群生长曲线测定将Rholow及Rhohigh亚群消化后,调整至3×107/L的细胞密度,以1mL/孔分别接种于3cm的培养皿中,2天换液,连续培养7天,每日各取3个计数,取平均值作为结果。设3个平行孔,实验重复3次,计算平均值。3、Rholow及Rhohigh亚群软琼脂克隆形成实验将Rholow及Rhohigh亚群密度调整至1×107/L,按1∶1混合12g/L琼脂糖和2×DMEM（含200mL/L小牛血清）,备底层琼脂1∶1混合7g/L琼脂糖和2×DMEM,加入细胞悬液40μL,制备上层琼脂。培养3周,计数克隆形成数。4、Rholow及Rhohigh亚群甲胎蛋白（AFP）免疫细胞化学AFP免疫细胞化学分析,4%多聚甲醛常规固定。免疫细胞化学采用SP法,操作步骤参照试剂盒说明书。一抗AFP mAb,工作浓度1:100,DAB显色,苏木精复染。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。胞质出现棕黄色颗粒定为阳性。应用Pro-Plus软件分析染色细胞平均光密度（IOD）比较两组细胞中AFP表达量。5、Rholow及Rhohigh亚群裸鼠成瘤实验将分选得到Rholow及Rhohigh亚群用无菌技术接种至裸鼠右侧背部皮下,每组肝癌细胞的接种细胞总数均为2×104个,每隔3天观察皮下肿瘤的生长情况。结果:1、HepG2细胞Rho123染色的分选流式细胞仪的分析结果显示有Rholow亚群存在,该群细胞占整个肝癌细胞总数的1.6%左右,加入钙通道拮抗剂后该群细胞明显减少,位于Rholow亚群的大部分肝癌细胞因低荧光的特征消失而进入到了Rhohigh亚群中。2、Rholow及Rhohigh亚群生长曲线测定Rho123low细胞比Rho123high细胞具有更旺盛的增殖能力,前者倍增时间16.9 h,后者24.7 h;前者最大增生倍数15.2,后者最大增生倍数为12.3。3、Rholow及Rhohigh亚群软琼脂克隆形成实验Rholow亚群在软琼脂中有较高的克隆形成率,而Rhohigh亚群在同样的生长条件下则生长迟缓,软琼脂培养中未见有明显的细胞克隆形成,说明Rholow亚群具有非常高的增殖潜能,Rholow亚群具有更强的增值特征。4、Rholow及Rhohigh亚群AFP免疫细胞化学两组细胞内均有AFP的阳性表达,阳性反应为显示位于细胞质的棕黄色颗粒,且阳性细胞主要集中在Rholow亚群,说明Rholow亚群具有更幼稚的细胞表型。5、Rholow及Rhohigh亚群裸鼠成瘤实验裸鼠荷瘤实验结果表明与Rhohigh亚群相比,Rholow亚群具有更高的致瘤能力。结论:利用Rho123/FCM可以富集具有干细胞特性的Rholow亚群,同时为进一步证实了肝癌异质性。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文（采用罗丹明123 分离肝癌细胞系HepG2 异质性亚群的鉴定）
• low及Rho^high亚群的分选'>实验一 肝癌细胞Rho^low及Rho^high亚群的分选
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• low及Rho^high亚群的生物学比较'>实验二 Rho^low及Rho^high亚群的生物学比较
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢