龟甲中促皮肤和骨修复愈合作用成分分析研究

论文摘要

目的分析动物药龟甲中的微量元素与常量元素、胶原蛋白和脂肪酸成分,以确定龟甲中促进皮肤和骨修复愈合作用的药效成分的组成和含量,为龟甲皮肤和骨修复愈合作用机制及药效学研究明确药效物质。方法实验一采用湿法HNO3-HClO4消解法消解,利用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）,测定龟甲中Na、K、Ca、Mg等常量元素,以及P、Sr、Ba、Mn、Fe、Cu、Zn等微量元素,并对龟甲中Ca的形态组成进行分析。实验二基于羟脯氨酸是胶原蛋白的特异性氨基酸,直接将龟甲中胶原蛋白酸水解为含羟脯氨酸的氨基酸水提液,经异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生化后,以A:0.1mol/L醋酸钠溶液-乙腈（94:6）（pH6.5）、B:乙腈-水（80:20）为二元流动相,经C18色谱柱分离,UV-VIS检测器于254nm处测定羟脯氨酸含量,再计算出龟甲中胶原蛋白的含量。实验三利用正己烷/异丙醇组成的低毒试剂（HIP溶剂法）,提取龟甲中的脂质成分,再通过皂化、萃取及ω-溴代苯乙酮衍生化,辅以催化试剂三乙醇胺,以甲醇:乙腈:水（325:135:50）为流动相,经C18色谱柱分离,UV-VIS检测器于242nm处检测十四酸、亚油酸、十六酸、油酸、十八酸等5种脂肪酸成分。结果实验一同时测定了Na、K、Ca、Mg、P、Sr、Ba、Mn、Fe、Cu、Zn等11种常量元素和微量元素,精密度RSD最低为Na元素0.46%,最高为Cu元素4.01%;所测定的6份供试品中11种常量元素与微量元素的平均回收率,最低为Mg元素90.90%,最高为Na元素109.14%;计算每种元素在龟甲中的含量分别为:Na 7.880mg/g、K 0.5071mg/g、Mg 2.896mg/g、Sr 0.3223mg/g、Ba0.1187mg/g、Mn 0.01864mg/g、Fe 0.5908mg/g、Cu 0.01543mg/g、Zn 0.1410mg/g、Ca 214.9mg/g、P 83.28mg/g,证实Ca、P最高,这与龟甲呈骨质结构以磷酸钙Ca3（PO4）2形态存在有关。此外,由磷酸钙分子式可知Ca/P分子量之比为2,而本实验数据得知,龟甲水溶液中Ca/P的含量比约为3,由此可推断龟甲水溶液液中存在游离态钙,经实验测定龟甲中游离态钙的平均含量为3.838mg/g。实验二实验所建立的分析方法线性范围为0.02～0.20mg/mL,r=0.9999,平均回收率为102.0%,RSD为2.47%,4个批次龟甲羟脯氨酸的含量分别为14.13 mg·g-1、14.20 mg·g-1、14.33 mg·g-1、14.39mg·g-1,由于羟脯氨酸在胶原蛋白中的含量约为10%,直接换算得出龟甲中胶原蛋白的含量约为14.25%。实验三同时检测出5种含量较多的脂肪酸成分,分别为十四酸、十六酸、十八酸、油酸、亚油酸,并建立了这5种脂肪酸的定量检测方法,十四酸的线性范围为0.05～0.45μg,r=0.9997,亚油酸的线性范围为0.10～0.90μg,r=0.9995,十六酸线性范围为0.10～0.90μg,r=0.9994,油酸的线性范围为0.10～0.90μg,r=0.9993,十八酸的线性范围为0.033～0.30μg,r=0.9996;平均回收率依次为100.27%,98.74%,101.94%,99.36%,97.99%,方法RSD分别为2.92%,3.76%,1.88%,2.55%,1.44%;测定了3批龟甲中的5种脂肪酸,其平均含量分别为0.0597μg/g、0.121μg/g、0.112μg/g、0.116μg/g、0.0472μg/g。结论本实验表明中药龟甲中所含促皮肤和骨修复愈合作用的药效成分组成复杂多样。在分析测定这些组分的实验中,首次使用了目前较为先进、快速的ICP-AES法测定龟甲中的常量元素和微量元素,并首次建立了分析龟甲中胶原蛋白的PITC柱前衍生化高效液相色谱方法及龟甲中脂肪酸成分的高效液相色谱方法,准确地测定了龟甲中胶原蛋白及5种脂肪酸成分的含量。目前对于中药中动物药的研究远不如植物药广泛深入,龟甲即是其中之一。本实验建立的三种分析方法,对快速、有效地分析动物药龟甲提供了新的分析方法,为进一步研究龟甲的促皮肤和骨修复愈合作用机制及药效学研究明确了药效物质。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 一、ICP—AES法分析龟板中常量与微量元素
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 二、异硫氰酸苯酯衍生化—HPLC法测定龟甲中胶原蛋白
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 三、柱前衍生化HPLC法测定龟甲中的脂肪酸
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 中药龟甲的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢