论文摘要
胃食管反流病（Gastroesophageal reflux disease,GERD）包括非糜烂性反流病（non-erosive esophageal reflux disease,NERD）、反流性食管炎（reflux esophagitis,RE）和Barrett食管（Barrett Esophagus ,BE）,是危害人们健康的常见疾病,严重者可发展成为食管腺癌。因GERD及其并发Barrett食管和食管腺癌的发病机制尚不明确,从一定程度上影响了对它们的诊断和治疗。Claudin蛋白家族是近年来被发现的穿膜蛋白,是紧密连接最重要的组成部分,维持着紧密连接的特有的屏障功能和栅栏功能。在正常食管粘膜,claudin 3和claudin 4蛋白基本不表达;而在肠化的BE食管上皮细胞和食管腺癌组织中,二者表达明显增高。NERD和RE是我国GERD最主要的2个亚型,然而迄今对claudin 3、4在NERD和RE患者食管粘膜中的表达变化规律及其影响因素尚不清楚,在BE表达增高的信号机制也未见报导。为此,本课题重点进行4方面的研究:1.采用RT-PCR、western blot和免疫组织化学等方法,分别对claudin 3、4在正常食管、NERD、RE和BE粘膜上皮的表达情况进行检测,以此初步探讨其在GERD临床诊断和治疗中的意义;2.采用便携式24h pH监测仪及便携式24 h胆红素监测仪,对NERD和RE患者食管内pH及胆红素实行24h双监测,并用RT-PCR法检测被测食管粘膜内claudin 4 mRNA的表达变化,以此探讨胃酸和胆汁酸反流与食管粘膜claudin 4表达的联系;3.采用MTT法检测胃酸、胆汁酸和TNF-α对小肠癌上皮细胞株活力的影响,以此选定合适的实验条件,再分别采用实时-PCR和激光共聚焦的方法,观察胃酸、胆汁酸和TNF-α对小肠癌上皮细胞株claudin 4mRNA和蛋白表达水平及细胞内分布的直接影响。4.采用p38激酶特异性拮抗剂（SB203580）,通过阻断p38激酶活化前后,western blot法检测胃酸、胆汁酸诱导的claudin 4蛋白表达的变化,以此研究p38激酶信号在胃酸和胆汁酸诱导的小肠上皮细胞claudin 4表达变化中的作用。主要结果如下:1.对80例GERD患者食管粘膜进行检测,发现claudin 3在正常食管,在NERD和RE的上皮,无论是mRNA,还是蛋白水平,不表达或微弱局灶表达;在肠化型BE上皮,claudin 3明显高表达。claudin 4在正常食管上皮微弱或不表达,而在NERD、RE和BE表达在mRNA和蛋白水平逐渐增强。免疫组化还发现claudin 3、4的着色在NERD和RE粘膜上皮主要在细胞膜;对于BE,二者不仅胞膜,胞浆内也出现阳性着色。2.对其中的48例GERD患者进行食管胃酸和胆红素监测,结果发现NERD组以无反流为主, RE组以混合反流为主,二者构成比相差显著;NERD组和RE组在pH<4总时间%、pH<4卧位时间%、酸反流次数、DeMeester积分、abs>0.14卧位时间%和胆汁反流次数等6个参数上存在明显差别（P<0.05）;RE组食管粘膜claudin 4 mRNA的含量显著高于NERD。单独酸反流、单独胆汁反流和混合反流组claudin 4 mRNA均显著高于无反流组（P<0.05）,单独酸反流和单独胆汁反流之间相差不显著（P>0.005）,混合反流组含量最高,显著高于其他各组（P<0.05）;GERD患者食管粘膜claudin 4 mRNA的含量与pH<4卧位时间%、酸反流次数,DeMeester积分,以及abs>0.14卧位时间%和胆汁反流次数等5个参数明显相关。3. MTT法结果显示pH选取的范围在pH 5.5～7.4,鹅脱氧胆酸（CDCA）50μM～200μM对小肠癌细胞株活力无明显毒性,可以作为合适的研究条件。激光共聚焦结果显示CDCA或盐酸随着作用时间增加和浓度增大, claudin 4 mRNA和蛋白的表达逐步增加;在刺激因素下蛋白表达的增强在HIC细胞内弥漫分布;在表达量和升高的速度上胆汁酸强于胃酸的作用;胆汁酸在pH 6.0的酸性培养基内的作用更高于单独胆汁酸的作用。TNF-α不同时间刺激后,claudin 4 mRNA和蛋白表达无显著变化。4.盐酸、CDCA单独或者混合刺激HIC细胞均可引起p38激酶活化,混合刺激活化p38激酶的程度明显高于单独刺激,同时伴有claudin 4蛋白表达的增高,使用p38激酶信号途径特异性拮抗剂SB203580,可以抑制p38激酶活化,同时可以抑制盐酸或胆汁酸单独刺激引起的claudin 4表达的增高,也可以部分抑制盐酸和胆汁酸混合刺激引起的表达增高。由上述结果得出以下结论:1.提示claudin 4表达的水平和粘膜病变程度密切相关,它表达增高有可能是食管粘膜上皮细胞紧密连接受损伤的标志,易引起粘膜损害的进一步加重;claudin 3是BE理想的诊断标志物和治疗的新靶点,claudin 3作为BE食管标志物的特异性要高于claudin 4。2.卧位酸、胆汁反流时间延长,反流的次数增多更易诱发RE,联合反流的效果更加明显。胆汁酸可能和胃酸一样,引起claudin 4的高表达,因而也是独立的食管粘膜损伤因子;胃酸、胆汁酸协同作用,更有致病性。卧位酸、胆汁反流时间和反流次数的增加是引起食管claudin 4表达增高的重要因素。3.胆汁酸或/和胃酸可能从基因转录和蛋白表达水平上直接影响barrett食管claudin4的表达,并具有时间和浓度效应。胆汁酸的作用强于胃酸,混合反流效果更加明显。尽管TNF-α未影响claudin 4的表达,但它在barrett食管的作用还需要进一步研究。4.胃酸、胆汁酸可能直接引起barrett食管的p38激酶活化,进而正向调节claudin 4蛋白的表达,除了p38激酶信号外,可能还存有其他调控机制参与claudin 4蛋白表达的增高。
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