灰葡萄孢菌激活蛋白的纯化、基因克隆与功能研究

论文摘要

激活蛋白是一类从真菌中分离的、具有激发子功能的新型蛋白质,可诱导多种植物产生系统抗性,促进植物生长,改善作物品质。为了进一步发掘具有我国自主知识产权的新型激活蛋白,本研究从灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）中分离获得了纯化的激活蛋白,确定了该激活蛋白在诱导植物抗病性和抗旱性方面的生物功能;克隆并获得了灰葡萄孢菌激活蛋白基因,分别实现了在大肠杆菌（Escherichia coli）和毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达,确定了表达蛋白的生物功能。该研究为利用工程菌株获得大量激活蛋白,研究并分析激活蛋白结构与功能的关系,从而为蛋白药物的分子设计奠定了基础。主要结果如下:通过沸水浴、离心、阴离子交换层析等方法,从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株的菌丝体中分离纯化出一种激活蛋白,命名为PebC1（protein elicitor botrytis cinerea1）。经SDS-PAGE银染显示该蛋白呈单一条带,相对分子量约为36kD,等电点为4.85。用胶内酶解的方法,采用MALDI-TOF/TOF等质谱技术对纯化的激活蛋白PebC1进行了肽段序列测定,获得3个重复性较好的可靠肽段。在NCBI上进行比对发现,该蛋白与来源于灰葡萄孢菌的蛋白XP001551609.1匹配率达95%。功能研究表明,灰葡萄孢菌激活蛋白PebC1能显著促进小麦幼苗生长、提高小麦抗旱性、诱导番茄对灰霉病的系统抗性。不同浓度激活蛋白浸泡小麦种子,11天株高均高于对照,其中以5μg/mL激活蛋白对小麦生长的促进作用最明显;激活蛋白处理的小麦根系活力比对照增加1.29倍,小麦幼苗抗旱综合系数也从36.53提高到57.08,说明激活蛋白增强小麦的抗旱性可能与增加小麦根系活力有一定的关系;用不同浓度的激活蛋白浸泡番茄种子,幼苗生长45天接种灰葡萄孢菌孢子悬浮液(浓度为104个孢子/mL),接种后14天番茄的病情指数明显低于对照,对灰霉病的诱抗效果达到31.95%～69.19%,其中10μg/mL激活蛋白处理对番茄的诱抗效果最为明显,接种后21天的诱抗效果仍达66.10%,说明灰葡萄孢菌激活蛋白PebC1不仅能显著增强番茄对灰霉病的抗性,而且诱抗效果持续时间较长。测定了PebC1处理后的番茄体内苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性的动态变化。经激活蛋白PebC1处理后,番茄幼苗叶片的PAL、POD和PPO活性均有不同程度的提高,PAL活性在诱导后24小时达最高,较对照增加46.84%;POD活性在诱导72小时出现活性高峰,较对照增加109.5%;PPO活性在72小时出现峰值,比对照增加111.0%。PAL、POD和PPO均是与植物抗病相关的防御酶,番茄防御相关酶活性的提高可能是激活蛋白诱导番茄植株抗灰霉病的主要生理机制之一,该研究为揭示激活蛋白诱导植物抗病性的作用机理提供了理论依据。通过反向遗传学的方法,获得了灰葡萄孢菌激活蛋白PebC1基因的cDNA序列,它与来源于灰葡萄孢菌的基因XM001551559完全一致。该基因编码的蛋白属于灰葡萄孢菌的alpha-NAC蛋白（nascent polypeptide-associated complex alpha polypeptide）,它含有保守的NAC结构域和UBA结构域,与来源于极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）的激活蛋白PeaT1基因的结构域相同,另外,PebC1和PeaT1二者在编码的氨基酸组成上也有79.4%的相似性,其中完全一致的氨基酸占71.0%。PebC1基因全长639bp,编码212个氨基酸,预测分子量为23080.2,等电点为4.57。亲水性分析发现该蛋白属于亲水性蛋白。进行了PebC1基因的原核表达。以原核表达系统中的pET-28a（+）为表达载体,将重组载体转入大肠杆菌Rossetta（DE3）菌株,通过IPTG诱导获得了PebC1基因的表达产物,利用（?）KTA explorer10蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化,选用Hitrap chelating Column柱进行亲和层析,得到了纯化的重组蛋白,并应用质谱分析鉴定了该基因表达的蛋白质为灰葡萄孢菌激活蛋白PebC1。功能测定结果表明,纯化的重组蛋白能促进番茄幼苗的生长,增强小麦的抗旱性。构建了PebC1毕赤酵母表达载体,获得了具有生物活性的分泌表达蛋白。用PCR法从灰葡萄孢菌cDNA中扩增获得PebC1的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/PebC1。重组质粒经BglⅡ线性化后电击导入毕赤酵母GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法进行筛选,获得了分泌表达的重组毕赤酵母菌株。用甲醇诱导PebC1表达,经SDS-PAGE检测证明,PebC1基因在毕赤酵母中成功分泌表达。生物活性试验表明,表达的PebC1蛋白能够诱导黄瓜幼苗对灰霉病的抗性,具有激活蛋白的生物功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 激发子的种类和性质
• 1.1.1 寡糖激发子
• 1.1.2 脂多糖激发子
• 1.1.3 糖蛋白激发子
• 1.1.4 多肽和蛋白类激发子
• 1.1.5 非生物激发子和物理刺激因子
• 1.2 激活蛋白研究现状
• 1.3 激发子诱导植物抗性的作用机制
• 1.3.1 激发子信号识别和信号转导
• 1.3.2 防卫基因的表达调控及其产物参与的抗病反应
• 1.4 激发子参与病害综合防治的前景与展望
• 1.4.1 激发子在田间的诱导抗性作用
• 1.4.2 激发子诱导抗性问题的探讨
• 1.4.3 诱导抗性在病害综合防治中的作用
• 1.5 本研究目的和意义
• 第二章 灰葡萄孢菌激活蛋白的纯化及其理化性质分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种及植物材料
• 2.1.2 试剂和仪器设备
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 灰葡萄孢菌激活蛋白的分离纯化及检测
• 2.2.2 蛋白质等电点的测定
• 2.2.3 激活蛋白氨基酸序列测定
• 2.3 讨论与小结
• 第三章 灰葡萄孢菌激活蛋白的生物功能
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 灰葡萄孢菌激活蛋白对小麦幼苗生长的促进作用
• 3.2.2 灰葡萄孢菌激活蛋白对小麦抗旱性及其根系活力的促进作用
• 3.2.3 灰葡萄孢菌激活蛋白对番茄抗灰霉病的促进作用
• 3.2.4 激活蛋白对番茄叶片苯丙氨酸解氨酶活性的影响
• 3.2.5 激活蛋白对番茄叶片过氧化物酶活性的影响
• 3.2.6 激活蛋白对番茄叶片多酚氧化酶活性的影响
• 3.3 讨论与小结
• 第四章 灰葡萄孢菌激活蛋白基因的克隆及序列分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株与克隆载体
• 4.1.2 试剂和仪器
• 4.1.3 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 灰葡萄孢菌总RNA的提取
• 4.2.2 灰葡萄孢菌激活蛋白的基因克隆及序列分析
• 4.3 讨论与小结
• 第五章 灰葡萄孢菌激活蛋白基因的表达
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株与质粒
• 5.1.2 植物材料
• 5.1.3 试剂和仪器
• 5.1.4 培养基组成
• 5.1.5 基因原核表达体系构建
• 5.1.6 基因真核表达体系构建
• 5.1.7 表达蛋白的生物学功能
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 PebC1在大肠杆菌中的表达
• 5.2.2 PebC1在毕赤酵母中的表达
• 5.3 讨论与小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A:激活蛋白序列质谱测定结果
• 附录B:缩写词及中英文对照
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录