羧甲基壳聚糖局部医药用膜材料的研制及性能评价

论文摘要

本文拟从设计出优良的牙周局部给药体系出发,采用先进的高分子材料加工工艺,复合羧甲基壳聚糖（CMCS）和聚乙烯醇（PVA）材料制备出CMCS/PVA共混膜和Cs2Ms-PVA多元结构微球嵌膜体系,研究两种膜材料的药剂学及生物学方面的特性,重点考察了羧甲基壳聚糖膜体系作为牙周局部药剂材料的潜力。现将实验过程及结果报道如下:通过碱化壳聚糖和氯乙酸的取代反映,制备了两组不同规格的羧甲基壳聚糖样品,随后采用红外和核磁技术刻画了制备的羧甲基壳聚糖样品,电位滴定方法分析了样品分子上羧基和氨基的解离情况,特别是研究了内在因素（Ds和Dd）和外在因素（离子强度及pH）对可电离基团解离系数的影响。其结果表明,羧甲基壳聚糖样品上的羧基和氨基在由酸至碱的滴定过程中,质子化的羧基和氨基历经了分别的去质子化过程。羧基和氨基的解离明显不同于CMC上羧基和CS上氨基的解离行为。表现为羧基pKa值随解离度呈现出先下降后平缓的解离趋势,对于此规律的解离趋势,可以用数学公式模拟出氨基解离曲线,进而可以考察而羧基固有pK的变化,也可以观测出各因素对羧基pK的影响,结果显示Ds和Dd的变化都轻微的改变了羧基的解离曲线;氨基pKa值在整个解离过程中表现为复杂的递增趋势,Ds对其解离影响明显。另外,离子强度增加总是表现出屏蔽氨基和羧基解离的效应。使用机械共混的方法制备了一系列CMCS/PVA共混膜,并在共混膜中加载了奥硝唑药物,通过肉眼和电镜观察观察了共混膜的外观,考察了共混膜的溶胀和体外药物释放特性,同时研究了共混膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果。结果表明共混膜透明均匀,但在微观下其相容性较差;高CMCS含量共混膜吸水剧烈,药物从中释放迅速,而高PVA含量的共混膜pH敏感性不强烈,抑菌性较差。为了考察CMCS/PVA共混膜作为药物包膜的潜力,我们也研究了小分子药物透过共混膜的释放情况。同样采用共混的方法制备CMCS/PVA共混膜,SEM检测提高共混膜中CMCS含量将造成共混膜表面粗造,横断面结构疏松,当CMCS含量升高到膜总重的50%时,吸水状态的共混膜呈现出多孔泡沫微观状态。CMCS的添加使共混膜具有了pH敏感性,表现为溶胀度随pH的升高而增大,高CMCS含量的共混膜尤其如此。采用改进的静态通透装置,研究了小分子模型药物透过共混膜的扩散情况,研究表明药物透过共混膜的扩散呈现出0级的药物释放趋势,提高CMCS含量,降低膜厚度以及增大介质pH值,都能使药物透膜的扩散加快。因此推测共混膜对小分子药物屏蔽不仅仅遵循孔型渗透机制。共混膜的体外血浆蛋白吸附是一种电性吸附为主导,疏水作用为辅助的吸附模式。当改变共混膜中CMCS含量,变动吸附蛋白类型,调整吸附介质（pH和离子强度）时,都会对膜上蛋白的静态平衡吸附量产生影响。总的来说,高CMCS含量膜的蛋白吸附量小,BSA比BFG更容易在膜上吸附,在偏酸环境中蛋白更易吸附,离子强度低的条件下蛋白更容易吸附。除了白蛋白及纤维蛋白原在膜上有吸附之外,共混膜还会对其它的血浆蛋白产生吸附。蛋白吸附模式表明了共混膜良好的生物相容性,甚至优于PVA膜。采用体内埋植的方法同样证明了共混膜优良的生物相容性,当共混膜埋植一定时间后,CMCS成分被机体溶解吸收,剩余PVA成分成为多孔蜂窝状微观结构。加载奥硝唑的共混药膜可以作为局部治疗牙周病的释药体系,载药共混膜具有强烈的抗厌氧菌性能,对豚鼠皮肤和大鼠牙周粘膜无刺激、无毒性,采用大鼠牙周炎动物模型实验显示药物在牙周局部浓度能长时间的维持较高浓度。我们设想一种新型的局部用药膜剂,该膜剂由载药微球分散包嵌在可溶性的外膜中构成。当用在局部位点时,外膜溶解,释放出载药微球,发挥药物特性。使用乳化交联的方法制备了羧甲基壳聚糖微球,同时在微球中加载了奥硝唑。载药微球的外观、粒经、药物包载量和包封率,以及体外药物释放速率都可以通过改变制备条件而加以控制。增加投料药材比可以增大药物包载量和减慢体外药物释放速率;而在制备时使用DMSO对药物助溶能够改善微球的外观,但是药物包载量降低,并且药物突释明显。综合考虑,使用不含DMSO的高载药微球分散在PVA膜中,形成一个多元结构复合膜。对于多元结构复合膜而言,外膜在接触水介质30 min时就开始溶解破碎,100 min时完全溶解释放载药微球,并能把微球封闭在局部。此性质有益于多元结构复合膜用在牙周局部。奥硝唑从微球和多元结构复合膜中释放表现出2级释放现象,在前两小时内为药物突释,紧随其后的一个缓慢释药过程。因此,可以通过改变微球或者多元结构复合膜的制备工艺达到调节药物释放速度的目的。新颖的多元结构复合膜的设计目的是针对牙周炎的治疗,因此需要对其生物安全性进行评价。生物学评价针对多元结构复合膜的核心（羧甲基壳聚糖微球,Cs2Ms）。采用溶血实验、蛋白吸附实验、及大鼠体内埋植实验对核心微球进行了评价,同时使用壳聚糖微球和PVA外膜作对照。体外实验结果显示,羧甲基壳聚糖微球无溶血性,且蛋白吸附量较壳聚糖微球少,蛋白吸附能力较弱,表明了羧甲基壳聚糖微球更高的生物相容性;体内埋植实验显示,微球埋植导致的炎症程度要高于PVA膜的埋植,虽然无法从体内埋植炎症判断羧甲基壳聚糖微球同壳聚糖微球的生物相容性优劣,但是微球埋植炎症反应对机体造成的伤害不甚明显,大鼠存活良好;体内外羧甲基壳聚糖微球的降解速度明显要快于壳聚糖微球,体外浸泡和体内埋植都能造成羧甲基壳聚糖微球的快速溶蚀,而壳聚糖微球降解缓慢,最终我们确信较短体内滞留时间就能使羧甲基壳聚糖被机体完全吸收,因此,羧甲基壳聚糖微球作为多元结构复合膜的核心适合牙周局部释药的目的。总之,能够使用羧甲基壳聚糖复合其它高分子材料设计出合理的牙周局部用药剂型。我们使用羧甲基壳聚糖所设计的两种膜材料在应用到牙周局部时仍有不完善之处,在其推广应用之前仍有很多工作要继续。

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中文摘要

ABSTRACT

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第一章引言（文献综述）

1 羧甲基壳聚糖的开发应用

1.1 医药卫生

1.2 食品保鲜

1.3 化妆品

1.4 废水处理

1.5 农业育种

2 羧甲基壳聚糖的生物活性

2.1 毒理学

2.2 提高免疫功能及抗肿瘤作用

2.3 抗心律失常作用

2.4 调节血脂及抗氧化作用

2.5 抗胃溃疡作用

2.6 抑菌作用

2.7 防治口腔疾病

3 医用壳聚糖膜的性能及用途

3.1 壳聚糖膜的性能

3.1.1 可降解性

3.1.2 生物相容性

3.1.3 促创伤愈合性

3.1.4 抗菌性能

3.1.5 药物控释性能

3.2 壳聚糖膜的医药用途

3.2.1 人工肾膜（透析膜）

3.2.2 人工皮肤

3.2.3 口腔溃疡膜

3.2.4 引导牙周组织再生（GTR）膜

3.2.5 透皮给药壳聚糖药膜与吞服给药壳聚糖药膜

3.2.6 其它医用壳聚糖膜剂

3.3 结语

4 局部药物制剂在牙周炎治疗研究的进展

4.1 药物治疗机制

4.2 局部缓控释制剂治疗牙周病的优势

4.3 局部缓控释制剂的临床应用

4.3.1 药膜剂

4.3.2 凝胶制剂

4.3.4 糊剂/软膏剂

4.3.5 线状剂

4.4 结语

5 课题依据及研究方案

5.1 研究背景

5.2 研究内容

5.3 技术路线

第二章羧甲基壳聚糖（CMCS）的荷电性及其影响因素

1 实验材料

1.1 试剂和材料

1.2 主要仪器

2 实验方法

2.1 不同脱乙酰度（Dd）壳聚糖样品的准备

2.2 羧甲基壳聚糖样品的制备

2.3 红外光谱分析

2.4 氢谱核磁共振分析

2.5 电位滴定

2.6 聚离子解离理论基础和数学模拟方法

3 结果

3.1 羧甲基壳聚糖的制备及其分子结构参数

3.2 红外光谱和核磁共振谱

3.3 羧基解离行为

3.4 氨基解离行为

3.5 体系离子强度对羧基和氨基团解离的影响

4. 讨论

5. 小结

第三章羧甲基壳聚糖/聚乙烯醇共混膜（CMCS/PVA）的制备及其性能

1 实验材料和仪器

1.1 实验材料

1.1.1 试剂

1.1.2 实验菌株

1.2 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 空白及载药共混膜的制备

2.2 共混膜的形态观察及透光率检测

2.3 共混膜的溶胀行为观察

2.4 共混膜在水溶液中的溶蚀

2.5 载药共混膜体外药物释放研究

2.5.1 奥硝唑柠檬酸盐缓冲液（pH3.5、7.4）标准曲线的建立

2.5.2 回收率和精密度

2.5.3 载药膜的体外药物释放实验

2.6 共混膜的抑菌性试验

3. 结果与讨论

3.1 共混膜的外观

3.2 膜的溶胀行为

3.3 体外药物释放

3.3.1 标准曲线

3.3.2 药物回收率和计算精密度

3.3.3 体外药物释放结果

3.4 共混体系的抗菌性

4 小结

第四章 CMCS/PVA 共混膜的药物通透性研究

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料

1.2 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 CMCS/PVA 共混膜的制备

2.2 共混膜的扫描电镜形态观察

2.3 共混膜的溶胀性测定

2.4 药物的共混膜通透实验

2.5 渗透系数及扩散系数的测定

2.6 药物分配系数的测定

3 结果及讨论

3.1 共混膜的形态学观察

3.2 共混膜的pH 依赖性溶胀

3.3 模型药物的透膜扩散

3.4 介质pH 对奥硝唑透膜扩散的影响

3.5 膜厚度对奥硝唑渗透扩散的影响

4 小结

第五章 CMCS/PVA 共混膜的血浆蛋白吸附模式及机体植入引起的应答反应

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料

1.2 实验动物

1.3 实验仪器

2 实验方法

2.1 溶血实验

2.2 血浆蛋白吸附实验

2.2.1 BSA 及BFG 的定量吸附实验

2.2.2 SDS-PAGE 检测膜对蛋白吸附

2.3 共混膜的大鼠皮下肌肉植入实验

3 结果和讨论

3.1 共混膜的溶血指数

3.2 体外共混膜的血浆蛋白质吸附

3.2.1 共混膜对BSA 和BFG 的吸附动力学

3.2.2 环境pH 变化对膜吸附蛋白的影响

3.2.3 离子强度对共混膜吸附蛋白的影响

3.2.4 共混膜吸附人血浆蛋白的SDS-PAGE 电泳

3.3 共混膜的组织埋植反应

3.3.1 组织炎症反应

3.3.2 埋植造成的共混膜溶蚀

4 小结

第六章载药CMCS/PVA 共混膜的药效学研究

1 实验材料和仪器

1.1 实验材料

1.1.1 试剂和药物

1.1.2 实验动物

1.1.3 试验菌种

1.2 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 皮肤过敏试验

2.2 口腔粘膜毒性及刺激性实验

2.2.1 实验动物模型制备

2.2.2 取材和观察

2.3 厌氧菌抑制实验

2.3.1 菌液的制备

2.3.2 标本的放置

2.4 体内释放度实验

2.4.1 实验前准备

2.4.2 实验动物模型制备

2.4.3 取材和观察

3 实验结果

3.1 豚鼠皮肤过敏实验

3.2 口腔黏膜毒性及刺激性实验

3.2.1 肉眼观察

3.2.2 组织学观察

3.3 体外抑菌效果

3.4 体内药物释放

4 讨论

4.1 抑制细菌生长在治疗牙周病中作用

4.2 牙周病局部治疗的进展

4.3 新剂型使用的安全性考虑

5 小结

第七章微球嵌膜多元结构药物载体的设想及制备

1 实验材料及仪器

1.1 材料及试剂

1.2 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 羧甲基壳聚糖微球的制备

2.2 载药羧甲基壳聚糖微球的制备

2.3 羧甲基壳聚糖微球（C52Ms）的特性研究

2.3.1 微球外观及粒径分布

2.3.2 微球的载药量及包封率测定

2.3.3 微球溶胀行为测定

2.4 微球嵌膜多元结构载体的制备

2.5 多元结构载体膜的水接触实验

2.5.1 多元结构复合膜变化观察

2.5.2 水介质黏度变化观察

2.6 体外奥硝唑释放实验

3 结果与讨论

3.1 羧甲基壳聚糖微球（C52Ms）的特性

3.2 多元结构复合膜的制备及特性

3.3 奥硝唑药物的体外释放

4 小结

第八章多元结构复合膜各成分的生物反应评价

1 实验材料及仪器

2 实验方法

2.1 溶血实验

2.2 微球体外降解实验

2.3 微球体外蛋白吸附实验

2.3.1 微球对BSA 的定量吸附

2.3.2 微球对BFG 的吸附

2.3.3 微球对人血清蛋白的吸附

2.4 大鼠肌肉微球埋植实验

2.5 统计学处理

3 实验结果

3.1 微球的溶血指数

3.2 蛋白在微球上的吸附

3.3 微球埋植炎症反应

3.4 微球的溶蚀降解

4 讨论

5 小结

全文总结

创新性

参考文献

个人简历

发表学术论文

研究生期间所获荣誉及奖励

致谢

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