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RIP3作为细胞凋亡与细胞坏死相互转换的分子开关的发现及机理研究

2020-12-07阅读(854)

RIP3作为细胞凋亡与细胞坏死相互转换的分子开关的发现及机理研究

论文摘要

细胞死亡根据形态学上的不同可分为细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡是细胞程序化的主动消亡过程，而细胞坏死则是发生于各种不同生理或病理状况的被动性死亡。尽管人们知道细胞坏死也会受某些内在程序调控，但是细胞坏死的详细机制以及细胞凋亡与细胞坏死之间相互转换的分子开关至今仍然是谜。肿瘤坏死因子（TNF）能引发两株遗传背景几乎相同的NIH-3T3细胞系分别表现出细胞凋亡和细胞坏死。通过遗传学和分子生物学手段，我们发现受体相互作用蛋白3（RIP3）是导致TNF诱导下两株细胞选择不同死亡方式的主因，RIP3是TNF诱导的细胞凋亡与细胞坏死相互转换的分子开关。RIP3不会影响RIP1介导的细胞凋亡，但却是RIP1介导的细胞坏死所必需的，同时caspase的广谱性抑制剂zVAD所导致的细胞坏死也需要RIP3的参与。此外，RIPP3还为其它多种细胞的坏死所必需。我们通过研究发现，RIP3是通过调节能量代谢而介导细胞坏死的。RIP3能够与细胞能量代谢途径的三个关键酶——糖原磷酸化酶（PYGL）、谷氨酰胺合成酶（GLUL）以及谷氨酸脱氢酶（GLUD1）发生相互作用并增强这些酶的活性，促使细胞充分利用糖原和氨基酸（谷氨酸或谷氨酰胺）作为代谢底物，致使细胞的整个能量代谢往前推进，并在旺盛的电子传递链上产生过量的具有细胞毒性的活性氧（ROS），从而导致细胞坏死。该论文发现了RIP3是细胞凋亡与坏死相互转换的分子开关，并揭示细胞能量代谢的调节会影响细胞选择不同的死亡方式。本论文的研究工作使人们更深入地了解了细胞坏死的机制以及与细胞坏死相关疾病的病因，也为临床上寻找治疗这类疾病的药物提供了新的基因靶点。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一章 前言
  • 1.1 细胞凋亡和细胞坏死
  • 1.1.1 细胞凋亡和细胞坏死的定义
  • 1.1.2 细胞凋亡和细胞坏死的机制
  • 1.1.2.1 细胞凋亡的机制
  • 1.1.2.2 细胞坏死的机制
  • 1.1.3 细胞死亡研究中的科学问题
  • 1.1.3.1 同一种刺激能诱导不同的细胞死亡
  • 1.1.3.2 细胞凋亡与细胞坏死之间的联系
  • 1.1.3.3 线粒体在细胞凋亡与细胞坏死中的作用
  • 1.1.3.4 ROS在细胞坏死中的作用
  • 1.1.3.5 zVAD和细胞死亡
  • 1.1.3.6 关于细胞坏死机制的最新研究
  • 1.2 肿瘤坏死因子（TNF）
  • 1.2.1 TNF简介
  • 1.2.2 TNF能诱导细胞凋亡和细胞坏死
  • 1.2.3 TNF可作为研究细胞死亡机制的模型
  • 1.3 受体相互作用蛋白（RIP）
  • 1.3.1 RIP家族简介
  • 1.3.2 RIP家族的结构特点
  • 1.3.3 RIP家族成员介绍
  • 1.3.3.1 RIP1
  • 1.3.3.1.1 RIP1简介
  • 1.3.3.1.2 RIP1介导TNF诱导的NF-κB激活
  • 1.3.3.1.3 RIP1参与TRIF信号通路中的NF-κB激活
  • 1.3.3.1.4 RIP1活性的反馈调节
  • 1.3.3.1.5 RIP1介导细胞死亡
  • 1.3.3.1.6 RIP1的选择:存活或死亡
  • 1.3.3.2 RIP2
  • 1.3.3.2.1 RIP2简介
  • 1.3.3.2.2 RIP2在先天免疫反应中的作用
  • 1.3.3.2.3 RIP2在适应性免疫反应中的作用
  • 1.3.3.3 RIP3
  • 1.3.3.3.1 RIP3简介
  • 1.3.3.3.2 RIP3能诱导某些细胞凋亡
  • 1.3.3.3.3 RIP3抑制NF-κB的激活
  • 1.3.3.3.4 过量表达RIP3诱导NF-κ3的激活
  • 1.3.3.3.5 RIP3在细胞内的定位
  • 1.3.3.3.6 RIP3的两个剪切异构体:RIP3β和RIP3γ
  • 1.3.3.4 RIP4
  • 1.3.3.5 RIP家族的其它成员
  • 1.4 立题背景
  • 第二章 材料和方法
  • 2.1 实验相关药品和试剂
  • 2.2 实验室主要仪器
  • 2.3 DNA相关实验和方法
  • 2.3.1 质粒载体
  • 2.3.1.1 普通真核表达载体
  • 2.3.1.2 慢病毒载体
  • 2.3.1.3 RNA干扰载体
  • 2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化
  • 2.3.2.1 感受态细胞的制备
  • 2.3.2.2 质粒转化感受态细胞
  • 2.3.3 质粒DNA的提取
  • 2.3.3.1 小量提取质粒DNA（STET煮沸法）
  • 2.3.3.2 中量提取质粒DNA（碱裂解法）
  • 2.3.3.3 大量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）
  • 2.3.4 质粒DNA的工具酶处理
  • 2.3.4.1 DNA的限制性内切酶消化
  • 2.3.4.2 双链DNA 5’突出末端平滑化
  • 2.3.4.3 线性DNA 5’末端磷酸化
  • 2.3.4.4 线性DNA 5’末端磷酸基团的移除
  • 2.3.5 DNA的回收和纯化
  • 2.3.5.1 DNA琼脂糖凝胶电泳
  • 2.3.5.2 从琼脂糖凝胶中回收DNA
  • 2.3.5.3 从溶液中回收DNA
  • 2.3.6 DNA连接反应
  • 2.3.7 cDNA表达谱芯片检测细胞内基因表达情况
  • 2.3.8 PCR相关实验
  • 2.3.8.1 普通PCR.反应
  • 2.3.8.2 PCR产物的克隆
  • 2.3.8.3 点突变
  • 2.3.8.3.1 引物设计
  • 2.3.8.3.2 点突变流程
  • 2.3.9 应用RT-PCR检测特定基因的表达情况
  • 2.3.9.1 细胞总RNA提取
  • 2.3.9.2 逆转录合成cDNA
  • 2.3.9.3 实时荧光定量PCR
  • 2.3.10 质粒载体的构建
  • 2.3.10.1 RIP3及RIP3各种突变和缺失体的构建
  • 2.3.10.2 RIP1慢病毒表达载体的构建
  • 2.3.10.3 PYGL、GLUL和GLUD1表达载体的构建
  • 2.3.10.4 shRNA引物设计
  • 2.4 细胞相关实验和方法
  • 2.4.1 细胞培养
  • 2.4.1.1 细胞培养基及相关溶液配制
  • 2.4.1.2 细胞的培养和传代
  • 2.4.2 细胞转染
  • 2.4.2.1 磷酸钙转染法
  • 2.4.2.2 脂质体2000转染法
  • 2.4.3 稳定表达细胞株的筛选
  • 2.4.4 慢病毒包装与感染
  • 2.4.4.1 慢病毒的包装
  • 2.4.4.2 慢病毒感染目的细胞
  • 2.4.5细胞存活率和ROS水平分析
  • 2.4.5.1 利用流式细胞仪检测细胞存活率
  • 2.4.5.2 MTT法检测细胞存活率
  • 2.4.5.3 利用流式细胞仪测量细胞内ROS水平
  • 2.5 蛋白质相关实验和方法
  • 2.5.1 免疫共沉淀
  • 2.5.2 免疫印迹
  • 2.5.3 相关溶液配制
  • 2.6 酶活性测定
  • 2.6.1 糖原磷酸化酶（PYGL）活性测定
  • 2.6.2 谷氨酰胺合成酶（GLUL）活性测定
  • 2.6.3 谷氨酸脱氢酶（GLUD1）活性测定
  • 第三章 结果与分析
  • 3.1 TNF引发两株NIH.3T3细胞以不同的方式死亡
  • 3.1.1 两株NIH-3T3细胞对TNF+zVAD的敏感性不同
  • 3.1.2 TNF分别诱导A细胞凋亡和N细胞坏死
  • 3.2 RIP3是细胞凋亡与细胞坏死相互转换的分子开关
  • 3.2.1 cDNA表达谱芯片分析两株细胞基因表达的差异
  • 3.2.2 RIP3是导致两株细胞不同死亡方式的主因
  • 3.2.3 RIP3在两株细胞内表达的差异
  • 3.2.4 RIP3是TNF诱导的N细胞坏死所必需
  • 3.2.5 重建了RIP3的A细胞表现出跟N细胞相同的死亡方式
  • 3.2.6 RIP3的激酶活性和RHIM结构域是其细胞死亡转换功能所必需
  • 3.2.7 RIP3是TNF诱导的L929细胞坏死所必需
  • 3.2.8 RIP3是zVAD引发的小鼠腹腔巨噬细胞坏死所必需
  • 3.3 RIP3与RIP1在细胞死亡过程中的相互关系
  • 3.3.1 RIP1是TNF诱导的N细胞和L929细胞死亡所必需
  • 3.3.2 过量表达RIP1诱导无RIP3的细胞凋亡和有RIP3的细胞坏死
  • 3.3.3 过量表达RIP1分别诱导A细胞凋亡和N细胞坏死
  • 3.3.4 RIP3和RIP1在过量表达导致的NIH-3T3细胞死亡中的关系
  • 3.4 RIP3介导细胞坏死的下游作用靶蛋白
  • 3.4.1 鉴定细胞坏死过程中与RIP3发生相互作用的蛋白
  • 3.4.2 RIP3能与PYGL、GLUL和GLUD1相互作用
  • 3.5 RIP3通过调节能量代谢介导细胞坏死
  • 3.5.1 RIP3能激活PYGL从而促进细胞能量代谢
  • 3.5.1.1 RIP3与PYGL在细胞坏死过程中发生相互作用
  • 3.5.1.2 RIP3能增强PYGL的活性
  • 3.5.1.3 敲低PYGL水平能抑制N细胞坏死
  • 3.5.2 RIP3能激活GLUL和GLUD1从而促进细胞能量代谢
  • 3.5.2.1 RIP3在细胞坏死过程中与GLUL和GLUD1相互作用
  • 3.5.2.2 RIP3能增强GLUL和GLUD1的活性
  • 3.5.2.3 敲低GLUL或GLUD1水平能抑制N细胞坏死
  • 3.6 RIP3介导的细胞坏死需要ROS的积聚
  • 3.6.1 N细胞坏死依赖于ROS的积聚
  • 3.6.2 RIP3是可导致细胞坏死的ROS积聚所必需
  • 3.6.3 PYGL、GLUL和GLUD1参与TNF+zVAD诱导的ROS产生
  • 3.6.4 能量代谢抑制剂对ROS产生和细胞死亡的作用
  • 3.6.5 能量代谢与ROS及细胞死亡相关
  • 3.7 zVAD增强RIP3介导的细胞坏死的机理探讨
  • 3.8 RIP3与细胞坏死相关疾病的关系
  • 3.9 总结
  • 附录1 图表索引
  • 附录2 缩略语及中英文对照
  • 参考文献
  • 在学期间发表的文章
  • 致谢

    • 相关论文文献

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