论文摘要
目的:通过动态观察同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）作用后的血管内皮细胞形态和功能的变化,以及对内皮细胞骨架肌动蛋白G-actin和F-actin的定性观察和定量分析,探讨Hcy通过损伤骨架肌动蛋白,并进而损伤血管内皮的可能机制。方法:人脐静脉内皮细胞株（ECV-304）体外培养,设正常对照组（Control）,低剂量Hcy组（0.1mmol/L）、中剂量Hcy组（0.5mmol/L）、高剂量Hcy组（1.0mmol/L）。Hcy分别作用6h、12h、24h后,倒置相差显微镜下观察内皮细胞形态的变化;用Rhodamine-Phalloidin标记纤维状肌动蛋白（F-actin）,Alexa Flour488-DnaseⅠ标记球状肌动蛋白单体（G-actin）,激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope,LSCM）观察内皮细胞骨架形态学变化,并用LSCM检测内皮细胞骨架G-actin、F-actin含量,计算G/F比值。分别采用硝酸还原酶法、硫代巴比妥酸法检测条件培养基中一氧化氮（NO）、脂质过氧化代谢产物丙二醛（MDA）的含量。结果:1.内皮细胞形态变化:倒置相差显微镜观察发现对照组内皮细胞为梭形或圆形,呈典型的鹅卵石样外观,细胞排列紧凑。不同剂量Hcy组内皮细胞形态均发生变化,随着时间的延长和/或Hcy剂量的增加,细胞出现皱缩,细胞间隙增大,在高剂量组时部分细胞甚至出现坏死脱落。2.内皮细胞骨架变化:（1）内皮细胞骨架形态变化:LSCM观察发现对照组内皮细胞F-actin在周边形成致密周围带,胞浆内有部分应力纤维。随着Hcy剂量的增加,外周致密带逐渐出现断裂、消散,胞浆内应力纤维变短、增粗,最终消失。随着时间的延长,内皮细胞F-actin重排,外周致密带局部出现断裂,而胞浆内应力纤维逐渐增多、增粗。对照组内皮细胞G-actin分布在核周,随着时间的延长和/或Hcy剂量的增大,G-actin逐渐向胞膜扩散,荧光强度增大。（2）内皮细胞骨架G-actin含量变化:6h、24h时,不同剂量Hcy组与同期对照组相比,G-actin含量随着剂量的增高逐渐上升;在12h时,G-actin总体含量增高,但没有明显的剂量依赖性。正常对照组与0.1mmol/L Hcy组随时间延长G-actin含量先升高,随之降低;在Hcy 0.5mmol/L组和1.0mmol/L组时G-actin含量均随时间延长逐渐增高。（3）内皮细胞骨架F-actin含量变化:6h、12h时,不同剂量Hcy组与同期对照组相比,F-actin含量升高,在低剂量Hcy组F-actin含量最高;24h时,F-actin含量随剂量增高呈上升趋势。高剂量Hcy组F-actin含量随时间延长逐渐增高,其它剂量组均是先升高再降低,但总体处于升高趋势。（4）G/F比值变化:6h时,不同剂量Hcy组与同期对照组相比,G/F比值升高,Hcy在浓度为0.5mmol/L时,比值在同期内达到最高。12h、24h时,G/F比值均随着剂量的增高而增大。各剂量组随时间延长G/F比值逐渐增大。3.内皮细胞功能变化:（1）NO含量变化:不同剂量Hcy组与同期对照组相比,随着剂量的增加,各时间段NO含量总体均呈下降趋势,但Hcy在浓度为0.5mmol/L,趋势出现轻微转折。随着时间的延长,NO含量总体呈下降趋势;在12h,相对6h、24h来说,NO含量偏高。（2）MDA含量变化:不同剂量Hcy组与同期对照组相比,随着剂量的增加,各时间段MDA含量总体呈上升趋势,随着时间的延长,各组MDA含量也呈上升趋势。结论:1.Hcy不仅损伤内皮细胞形态,并降低内皮源性NO产量,促进脂质过氧化产物MDA含量的增加,对内皮功能也存在明显影响。2.Hcy引起内皮细胞骨架重排,并通过改变骨架蛋白G-actin和F-actin含量,以及G/F比值来参与调节内皮细胞形态和功能的损伤。
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