产丁二酸菌种筛选及发酵工艺条件优化的研究

论文摘要

琥珀酸是一种二元羧酸,在三羧酸循环中产生,同时也是厌氧发酵的代谢产物之一。琥珀酸作为一种重要的化学合成前体,广泛应用于食品、化学和医药工业。微生物发酵法生产琥珀酸成为绿色工艺不仅是因为利用可再生资源,而且在发酵过程利用CO2减少了温室效应。因此,微生物发酵法生产琥珀酸是具有发展前景的方法之一。本论文对厌氧发酵琥珀酸产生菌的筛选、初步鉴定及发酵工艺进行了研究,主要研究内容和结果如下:建立一种快速经济的琥珀酸定性半定量分析方法化学荧光圈法。能满足菌种筛选过程对琥珀酸分析的要求,是经济、有效的分离和筛选产琥珀酸菌种的方法。研究了用于分析有机酸的HPLC条件。高效液相色谱仪为安捷伦1100,色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-Aq柱（150 mm×4.6 mm,5μm）,进样量10μL,流动相流速0.5 mL/min,检测波长210 nm,流动相:0.5 %乙腈、99.5 % 0.02 mol/L KH2PO4、调pH至2.0 （用磷酸调节）,柱温30℃。从牛的瘤胃中分离得到产琥珀酸菌株JNUBE0709,初步发酵实验琥珀酸浓度为9.45 g/L,且该菌产生的杂酸种类相对较少,以甲酸、乙酸为主,因此将JNUBE0709作为本论文实验的出发菌。对产琥珀酸JNUBE0709基本生理生化性质鉴定,多数生理生化特征与琥珀酸放线杆菌相似。初步鉴定此菌种为产琥珀酸放线杆菌。通过单因素试验确定影响JNUBE0709发酵产琥珀酸三个显著因素,并进一步采用响应面分析显著因素的浓度范围。优化后最佳发酵培养基组成为（g/L）:麦芽糖51.1,酵母膏24.5,KH2PO4 3,KCl 3,NaCl 3,MnCl2 0.06,MgCO3 40.4,pH自然。在优化条件下琥珀酸的产量达到33.45 g/L,比优化前的产量提高了74.49 %。研究了JNUBE0709发酵产琥珀酸的工艺条件,实验结果表明最佳培养条件为:100 mL厌氧瓶装液量25 mL,接种量为5 %,转速200 r/min,发酵温度为37℃,发酵周期48 h。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 琥珀酸理化性质
• 1.2.1 琥珀酸物理性质
• 1.2.2 琥珀酸化学性质
• 1.3 琥珀酸国内外应用市场
• 1.4 琥珀酸的制备方法
• 1.4.1 化学合成法
• 1.4.2 生物转化法
• 1.4.3 微生物发酵法
• 1.5 产琥珀酸的主要微生物
• 1.5.1 产琥珀酸厌氧螺菌的研究进展
• 1.5.2 产琥珀酸放线杆菌的研究进展
• 1.5.3 大肠杆菌的研究进展
• 1.5.4 产琥珀酸Mannheimia succiniciproducens 的研究进展
• 1.5.5 其他菌株研究进展
• 1.6 琥珀酸的提取
• 1.7 本论文研究目的与研究内容
• 1.7.1 研究目的
• 1.7.2 研究内容
• 第二章 主要分析方法的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验试剂
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.2.3 菌种
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 发酵液残糖的测定
• 2.3.2 生物量的测定
• 2.3.3 琥珀酸定性半定量测定
• 2.3.4 HPLC 测定有机酸
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 麦芽糖标准曲线
• 2.4.2 生物量标准曲线
• 2.4.3 琥珀酸定性半定量测定
• 2.4.4 HPLC 条件确定
• 2.5 本章小结
• 第三章 琥珀酸菌种的筛选
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验试剂
• 3.2.2 仪器与设备
• 3.2.3 菌种
• 3.2.4 各种培养基
• 3.2.5 试验方法
• 3.2.6 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 筛菌方案
• 3.3.2 富马酸钠浓度试验
• 3.3.3 琥珀酸菌种筛选
• 3.3.4 产琥珀酸JNUBE0709 菌种菌落基本形态
• 3.3.5 产琥珀酸JNUBE0709 菌种基本生理生化特性
• 3.4 本章小结
• 第四章 琥珀酸厌氧发酵工艺条件优化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验试剂
• 4.2.2 仪器与设备
• 4.2.3 试验菌种
• 4.2.4 各种培养基
• 4.2.5 实验方法
• 4.3 培养基优化试验设计
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 种子培养基成份的确定
• 4.4.2 菌体生长曲线
• 4.4.3 碳源浓度的确定
• 4.4.4 碳源的优化
• 4.4.5 氮源优化
• 4.4.6 麦芽糖浓度对发酵产酸的影响
• 4.4.7 酵母膏浓度对发酵产酸的影响
• 4.4.8 无机盐离子对菌种发酵产琥珀酸的影响
• 3 的加量对琥珀酸产量的影响'>4.4.9 MgCO₃的加量对琥珀酸产量的影响
• 4.4.10 响应面优化发酵培养基中三个显著因素
• 4.4.11 琥珀酸发酵条件的研究
• 4.5 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文