脑型钠尿肽对大鼠视网膜双极细胞上γ-氨基丁酸受体的调制

论文题目: 脑型钠尿肽对大鼠视网膜双极细胞上γ-氨基丁酸受体的调制

论文类型: 博士论文

论文专业: 神经生物学

作者: 禹永春

导师: 杨雄里

关键词: 脑型钠尿肽,受体,神经传递,胞内钙,视网膜,双极细胞

文献来源: 复旦大学

发表年度: 2005

论文摘要: 脑型钠尿肽对大鼠视网膜双极细胞上γ-氨基丁酸受体的调制钠尿肽（natriuretic peptide，NP）是一类结构相似的肽类物质的总称，包括心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、脑型钠尿肽（brain natriuretic peptide，BNP）和C型钠尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）。它们起源于不同的基因，但都拥有一个结构类似的17个氨基酸内环。钠尿肽及其相应的钠尿肽受体（natriuretic peptide receptor, NPR；NPR-A，NPR-B，NPR-C）分布于整个中枢神经系统（central nervous system，CNS），提示NPs及其受体在CNS中可能起到了非常重要的神经调质作用。近年来的研究表明，NPRs参与调控情绪变化、应激激素的释放、摄食、觉醒及自主神经的节律。然而，NPs参与神经信号传递调控却所知甚少。双极细胞（bipolar cell，BC）在视网膜中是第二级神经元，在视网膜中它可以将光感受器获得的视觉信号传递给无长突细胞（amacrine cell，AC）和神经节细胞（ganglion cell，GC）。通过激活BCs上不同的谷氨酸受体，两种类型的双极细胞（ON型BC和OFF型BC）可以产生ON型和OFF型信号通路。在哺乳动物视网膜中，双极细胞也可以分为视杆双极细胞（rod bipolar cell，RBC）和视锥双极细胞（cone bipolar cell，CBC），并且大量研究表明所有的RBC都是ON型的，而CBC既有ON型的也有OFF型的。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）受体的两个亚型GABAA和GABAC主要存在于BC的树突和轴突上。在本工作中，我们应用免疫组织化学方法、全细胞膜片钳记录结合快速溶液切换装置（RSC-100）、钙成像技术，首次系统地报道，BNP通过与NPR-A受体结合增加胞内钙浓度(intracellular calcium concentration，[Ca2+]i)，从而抑制大鼠双极细胞上GABA受体介导的电流。这项研究不仅揭示了NPs作为神经调质在视网膜的重要作用，也为我们进一步了解NPs在CNS中的作用提供了非常重要的启示。通过免疫组织化学的方法，我们观察到两种钠尿肽受体NPR-A和NPR-B广泛地表达在大鼠视网膜外网状层（outer plexiform layer,OPL）和内网状层（innerplexiform layer, IPL），并且证实两种受体在BC上均有较强的表达。NPR-A和NPR-B两种受体在BC上的亚细胞分布是非常类似的。无论是PKC阳性表达的ON型RBC还是PKC阴性表达的OFF型BC，NPR-A和NPR-B几乎表达在它们所有亚细胞部位，包括树突、胞体、轴突和轴突终末。利用全细胞膜片钳技术，将BC的细胞膜电位钳制在-60 mV时，在约一半分离大鼠的BCs上，NPs可以诱导出一种内向电流。由ANP和BNP引导的内向电流可以被NPR-A的特异性抑制剂anantin完全阻断，提示ANP和BNP是通过NPR-A介导的内向电流。进一步研究表明，NPs所诱导的电流翻转电位在-8 mV，可以完全被胞外Cd2+和胞外无阳离子（cation-free）溶液所阻断，并且可被胞外无钙(Ca2+-free)溶液所增强，这些结果均提示该电流是cGMP诱导的非选择性阳离子电流（cGMP-gated nonselected cation channel，CGC）。为了进一步验证CGC的确表达在分离的BCs上，我们在胞内给予了cGMP来引导CGC电流。当电极内液中给予4 mM cGMP，我们同样引导出了一个性质类似的内向电流。另外，当胞外给予磷酸二脂酶（phosphodiesterase，PDE）的抑制剂1mM IBMX，在BCs上同样可以诱导出一个显著的内向电流。我们进一步分析了大鼠视网膜双极细胞上GABA受体所介导电流的特性。50μM的GABAA受体激动剂muscimol可以诱导一个失活较快的瞬间的内向电流，通过公式拟合可以计算出它的失敏时间常数（τ）是1.24s。200μM GABAC受体激动剂cis-4-aminocrotonic acid（CACA）可以诱导出一个持续的几乎无失敏的内向电流。GABAB受体激动剂baclofen在BCs上诱导不出任何可见电流。GABAA受体介导电流的翻转电位是1.2±2.4 mV，而GABAC受体所介导电流的翻转电位是-1.4±3.2 mV。通过分析引导GABAA电流和GABAC电流对GABA的量效关系，可以得到GABAA受体介导电流的半反应浓度(concentration of half-maximal response，EC50)是51.3±6.2μM，而GABAC受体介导电流的EC50是6.0±0.6μM。这个结果提示，GABA对GABAC受体的亲和力大约是GABAA受体亲和力的8倍。进一步研究表明，BNP可以显著抑制GABAA电流而对GABAC电流无影响。BNP的抑制作用可以被anatin阻断，而NPR-C受体特异性激动剂c-ANT不能模拟BNP的作用，这表明BNP的抑制作用是通过NPR-A起作用的，NPR-C受体不参与这一作用。与BNP类似，胞外给予8Br-cGMP同样可以抑制GABAA电流而对GABAC电流无影响。胞外给予pGC-A／B的特异性抑制剂HS-142-1可以显著地抑制BNP的作用。这些结果提示，BNP抑制GABA电流的作用是通过与NPR-A结合后提高胞内cGMP的水平而实现的。当电极内液中给予cGMP依赖蛋白激酶G（cGMP-dependent protein kinase G，PKG）的特异性抑制剂KT5823可以显著地削弱BNP抑制GABA的作用。另外，钙成像实验表明BNP可以显著地增加BCs的[Ca2+]i。当胞外持续给予Ca2+-free溶液（含10 mM EGTA），GABA电流没有显著的变化。在胞外无钙条件下，BNP仍可抑制GABA电流。然而，当细胞内处于Ca2+-free的条件下（含10 mM BAPTA），可以显著地增加GABA电流。并且在胞内Ca2+-free条件下，BNP抑制GABA电流的作用几乎消失。这些结果表明，在我们的实验条件下BNP抑制GABA电流的作用是通过增加[Ca2+]i来实现的，而胞外钙离子并不参与这一作用。当胞内给予IP3受体的抑制剂heparin和xestospongins-C阻断胞内IP3受体介导的钙库释放，BNP仍可以显著地抑制GABA电流。然而，应用ryanodine受体的调节剂咖啡因、ryanodine、钌红来阻断ryanodine受体介导的钙库释放途径，可以明显地抑制GABA电流，并且在此条件下BNP抑制GABA电流的作用几乎完全消失。进一步研究表明，BNP抑制GABA电流的作用可以显著地被钙调蛋白（calmodulin，CaM）抑制剂W-7和calmidazolium所阻断。因此本实验结论是，BNP与NPR-A受体结合后通过激活cGMP／PKG途径诱导ryanodine受体介导的钙释放再激活CaM途径对BC上的GABA电流产生抑制作用。

论文目录:

缩略语及符号

一、中文摘要

二、英文摘要

三、正文

(一)、前言

(二)、材料和方法

1.免疫荧光组织化学

1.1 标本的制备

1.2 免疫荧光组织化学反应

1.3 共聚焦激光扫描显微镜观察

2.Western blot分析

3.酶解分离大鼠网膜神经元

4.全细胞膜片钳记录

4.1 施药系统

4.2 膜片钳实验装置

4.3 溶液和药品

4.4 数据处理

5.钙成像

(三)、实验结果

1.分离的大鼠双极细胞及其分类

2.NPR-A和NPR-B在大鼠视网膜上的分布

2.1 NPR-A和NPR-B在大鼠视网膜抗体特异性分析

2.2 NPR-A和NPR-B在大鼠视网膜垂直切片上的分布

2.3 在视网膜垂直切片上,NPR-A和NPR-B在双极细胞上的亚细胞分布

2.4 在分离双极细胞上,NPR-A和NPR-B的亚细胞分布

3.在分离的BCs上,NPs诱导的cGMP门控电流

3.1 NPs诱导内向电流

3.2 BNP诱导内向电流的药理学特性

3.3 BNP诱导内向电流翻转电位的测定

3.4 cGMP和IBMX诱导cGMP门控电流及其药理学特性

4.大鼠BC上GABA受体的特性

4.1 GABA受体的亚型及其药理学特性

4.2 GABA_A受体和GABA_C受体介导电流翻转电位的测定

4.3 GABA对GABA_A受体和GABA_C受体亲和力的测定

5.BNP对GABA电流的影响

5.1 BNP对GABA电流的抑制作用

5.2 NPR-A和NPR-C对BNP抑制GABA电流的影响

5.3 BNP分别对GABA_A电流和GABA_C电流的影响

6.cGMP/PKG通路对BNP抑制GABA电流的调控

6.1 pGC和cGMP对BNP抑制GABA电流的影响

6.2 PKG对BNP抑制GABA电流的影响

7.Ca~(2+)对BNP抑制GABA电流的影响

7.1 BNP对[Ca~(2+)]_i的影响

7.2 细胞内、外Ca~(2+)的参与

8.胞内钙库对BNP抑制GABA电流的影响

8.1 IP_3受体介导钙库释放的作用

8.2 ryanodine受体介导钙库释放的作用

9.钙调蛋白对BNP抑制GABA电流的影响

(四)、讨论

1.功能性的NPRs在BC上的表达

2.BNP对GABA_A电流压抑,面对GABA_C电流没有影响

3.BNP抑制GABA电流的胞内机制

4.NPs在视网膜中可能的生理作用

(五)、总结

(六)、参考文献

(七)、其他研究内容:

四、综述:

五、后记

1.学习期间完成的论文和摘要

2.致谢

发布时间: 2007-06-28

参考文献

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