论文摘要
低分子量肝素（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）是二十世纪八十年代在研究肝素分子构效时发展起来的一类新型生化药物，是由肝素以不同的工艺分级或降解而成的低分子量的组分或片段，具有肝素的基本结构，分子量一般为4kDa～6kDa。与肝素相比，低分子量肝素具有分子小、易吸收、生物利用度高、半衰期长、量效关系明确、低抗凝、高抗栓、出血副作用少等特点，在临床中得到较广泛的应用。上世纪90年代初，有人开始探讨肝素类药物在阿尔茨默病（Alzheimer’s disease，AD）中的作用，并取得了一些研究成果。目前已明确肝素是IP3受体拮抗剂，可以拮抗IP3所介导的细胞内钙库的内钙释放。三磷酸肌醇（IP3）是生物体内重要的第二信使，可与内质网（ER）上的IP3受体结合而导致细胞内Ca2+释放，参与调节神经细胞的多种生理生化功能。新近研究证实IP3／Ca2+信号通路在阿尔茨默病（AD）的病理过程中起着重要作用。本课题选用山东大学药学院生化与生物技术药物研究所研制的低分子量肝素（平均分子量为5.5KDa），通过对其拮抗谷氨酸等诱导的细胞毒性；抑制神经细胞内钙浓度升高；对抗神经细胞凋亡等方面的研究，旨在验证和阐明LMWH神经细胞保护作用及其可能的机制。一、LMWH对培养大鼠神经元的保护作用：通过原代培养大鼠大脑神经细胞，我们研究了LMWH对神经细胞的保护作用。使用谷氨酸、高浓度氯化钟、过氧化氢和叠氮钠造成神经细胞不同的损伤模型，考察LMWH对这些因素引起神经细胞损伤的保护作用。主要通过MTT法，测定神经细胞存活率的变化，研究LMWH对谷氨酸引起的细胞内乳酸脱氢酶（LDH）外漏的影响。结果发现LMWH可对抗谷氨酸、氯化钾、过氧化氢以及叠氮钠对神经细胞的损伤，提高细胞存活率。10μg·ml-1的LMWH对上述损伤因素引起的细胞存活率分别为90.1％，82.7％，81.9％和75.9％，较相应的模型组分别增加了13.3％，27.9％，66.3％和24.0％。谷氨酸可以非常显著地诱导神经细胞内乳酸脱氢酶外漏，LMWH对其有抑制作用。二、LMWH对凋亡神经细胞的影响：谷氨酸可造成培养大鼠神经细胞的凋亡，通过流式细胞仪测定细胞凋亡率，蛋白印渍的方法测定神经细胞内Bcl-2，Bax和Caspase 3的表达，考察LMWH对神经细胞凋亡的影响。结果表明，谷氨酸处理后，细胞凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白表达下降，Bax和Caspase 3的表达升高，而LMWH各剂量组均可以显著降低细胞的凋亡率，增加Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax和Caspase 3的表达。三、LMWH对神经细胞内钙浓度的影响：采用Ca2+敏感荧光指示剂Fura-2／AM负载大鼠神经细胞，测定神经细胞内游离钙离子浓度。结果显示谷氨酸可明显引起细胞内游离钙离子浓度的增加（P＜0.01），LMWH可显著抑制谷氨酸所诱导的细胞内钙浓度升高，0.1μg·ml-1的LMWH其抑制率达到52.57％，并随浓度的增加而增强。四、LMWH对神经细胞线粒体膜电位的影响：谷氨酸诱发的神经细胞损伤能引起细胞线粒体膜电位的降低。由于荧光染料罗丹明123（Rh123）主要聚集在细胞线粒体内，通过使用流式细胞仪来测定细胞内的Rh123荧光强度可以反映细胞线粒体膜电位的变化。LMWH能够抑制谷氨酸引起线粒体膜电位的变化。说明了LMWH可以影响细胞内的能量代谢，这与LMWH抗神经细胞凋亡作用所一致。这些作用可能都参与了LMWH对神经细胞的保护作用，但是关于详细的神经保护机制还有待进一步研究。总之，LMWH可以通过其抑制细胞内钙离子浓度升高，抗神经细胞凋亡，改善细胞线粒体膜电位，对多种因素造成的神经细胞损伤具有保护作用。