论文摘要
诱导多潜能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPS cells）是成体细胞在外源因子作用下,经直接细胞核程序重整而重新获取多潜能的干细胞。iPS细胞在应用上无伦理和免疫排斥问题,其在疾病模型建立与机理研究、细胞治疗、药物发现与评价等方面极具应用价值。迄今,大鼠、人、猪、猴和兔的iPS细胞系皆已建立,并证实小鼠iPS细胞具有ES细胞的发育全能性; iPS细胞在疾病模型研究、药物的发现与评价上已取得重大成果。然而,iPS细胞的研究面临重编程效率低和其成瘤风险两大挑战,基于iPS细胞的肝癌疾病模型未建立。脂肪组织易于大量获取且对供体伤害性小,其来源脂肪干细胞（ adipose-derived stem cells, AdSCs）的分离方法简单、快捷。脂肪干细胞作为一个异质性的细胞群体,其自我更新的同时维持向脂肪细胞、肌肉细胞、成骨细胞和软骨细胞类型的特定分化能力。我们认为脂肪干细胞处于分化状态与未分化状态之间,这种状态可能有助于iPS细胞的生成。本课题中,主要的实验方法如下:（1）质粒pMXs-Oct4、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4、pMXs-c-Myc和pMXs-EGFP的抽提和逆转录病毒生产;（2）脂肪组织的采集和脂肪干细胞的分离、原代培养与鉴定;（3）逆转录病毒感染脂肪干细胞,脂肪干细胞被重编程为iPS细胞;（4）iPS细胞的培养与鉴定（碱性磷酸酶染色,定量RT-PCR和免疫荧光等）。结果:我们利用逆转录病毒做载体携带转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc重编程50到60岁肝癌患者来源脂肪干细胞为iPS细胞。表明脂肪干细胞能高效地重编程为iPS细胞;我们采用形态学鉴定的方法筛选出iPS细胞;且证实其能在无滋养层的条件下培养。这项研究为成体细胞重编程为iPS细胞的技术改进和建立基于iPS细胞的肝癌模型奠定基础。
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摘要Abstract缩略词表第一章 前言1 诱导多潜能干细胞2 转录因子2.1 Oct42.2 Sox22.3 Klf42.4 c-Myc3 诱导多潜能干细胞的研究4 诱导多潜能干细胞的应用4.1 疾病模型构建与机制研究4.2 细胞治疗4.3 药物发现与评价5 诱导多潜能干细胞存在问题5.1 重编程效率低5.2 安全性6 脂肪干细胞7 本研究课题主要研究内容8 本研究课题的创新性与意义第二章 携带干细胞特异性转录因子的病毒生产１试验材料1.1 试验试剂1.2 主要仪器与设备1.3 主要试剂配制2 试验方法及步骤2.1 质粒DNA的制备与鉴定2.2 逆转录病毒的包装与生产2.3 收获逆转录病毒3 试验结果3.1 指示质粒pMXs-EGFP的包装效果第三章 脂肪干细胞的分离与培养及病毒感染1 脂肪干细胞的分离与培养1.1 试验材料1.2 试验试剂1.3 主要仪器与设备1.4 主要试剂配制2 试验方法及步骤2.1 脂肪干细胞原代培养和传代及冻存2.2 脂肪干细胞生长曲线测定2.3 病毒pMXs-EGFP预感染脂肪干细胞3 试验结果3.1 原代脂肪干细胞3.2 脂肪干细胞的生长曲线3.3 病毒pMXs-EGFP预感染脂肪干细胞4 携带转录因子的逆转录病毒感染脂肪干细胞4.1 试验试剂4.2 主要仪器与设备4.3 主要试剂配制5 试验方法及步骤5.1 病毒感染脂肪干细胞6 试验结果6.1 携带转录因子基因的逆转录病毒诱导出克隆第四章 诱导多潜能干细胞的培养与鉴定1 试验材料1.1 试验试剂1.2 主要仪器与设备1.3 主要试剂配制2 试验方法和步骤2.1 碱性磷酸酶染色Ⅱ 第一链cDNAⅢ.定量PCR（qRT-PCR）3 实验结果3.1 克隆细胞AP染色阳性3.2 克隆细胞表达Oct4 和Sox23.3 定量PCR结果第五章 讨论与结论1 讨论1.1 携带干细胞特异性转录因子的逆转录病毒制备1.2 脂肪干细胞的分离与培养1.3 携带转录因子的逆转录病毒感染脂肪干细胞1.4 诱导多潜能干细胞的培养与鉴定2 结论参考文献在研期间论文发表致谢
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