新疆沙冬青（Ammopiptanthus nanus）抗寒相关基因的分子克隆及表达分析

论文摘要

本研究以抗寒性极强的新疆沙冬青为材料,克隆得到了抗寒相关的酶蛋白基因AnGPAT全序列和抗逆转录因子基因AnICEa和AnICEb的部分序列,并对各基因进行了序列分析及分子进化分析,同时对AnGPAT基因进行了原核体外表达和转基因载体构建。为不同抗寒基因的协同作用机制研究,以及抗逆新基因的发掘与基因工程育种奠定了基础。主要结果如下：1.经同源克隆和RACE方法成功克隆了新疆沙冬青GPAT基因的cDNA全序列,命名为AnGPAT。其基因全长1482 bp, ORF长1380 bp,编码一个由460个氨基酸残基组成的多肽。对该基因编码的氨基酸进行分析,预测分子量为50.9KD,等电点为7.38。保守性功能区搜索发现从201到436位氨基酸残基为GPAT保守功能域（LPLATs）。进化分析表明,AnGPAT与蚕豆（Vicia faba）和油棕（Elaeis guineensis） GPAT蛋白亲缘关系最近。2.经同源克隆和染色体步移技术获得了两个同源ICE基因,分别命名为AnICEa和AnICEb.在两基因中都发现了ICE基因保守功能域bHLH。对不同物种ICE基因编码的氨基酸全序列和C端序列同源比对后进化分析表明：AnICEa与大豆（Glycine max） ICE蛋白聚为一类,AnICEb与萝卜（Raphanus sativus）,拟南芥（A.thaliana） ICE蛋白亲缘关系较近。3.将AnGPAT基因的开放阅读框插入表达载体pET-30 a（+）的MCS区,获得了pET-30a-GPAT大肠杆菌表达载体。转化大肠杆菌BL21后,在37℃经1 mM IPTG诱导后获得一个大约51 kDa的融合蛋白,和预测大小一致。4.通过构建中间表达载体pGM-35S-GPAT-NOS,使得AnGPAT连接上强启动子和终止子。把35S-GPAT-NOS片段插入到pCAMBIA2300的MCS区,成功构建了p2300-35S-GPAT-NOS真核表达载体。为后续利用转基因技术进行基因功能研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 冷胁迫和转录调控级联机制
• 1.1.1 冷胁迫
• 1.1.2 ICE-CBF-COR转录调控级联机制
• 1.2 植物抗寒基因工程
• 1.2.1 导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因的研究
• 1.2.2 导入抗氧化酶基因的研究
• 1.2.3 导入渗透调节相关基因的研究
• 1.2.4 导入抗寒调控基因的研究
• 1.3 沙冬青的抗逆特性研究
• 1.3.1 抗旱性
• 1.3.2 抗寒性
• 1.3.3 抗盐性
• 1.4 研究思路
• 第二章 GPAT基因的克隆及序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 主要仪器及生物软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 新疆沙冬青总RNA的提取
• 2.2.2 反转录合成第一链cDNA
• 2.2.3 GPAT基因的PCR扩增
• 2.2.4 PCR扩增产物的胶回收
• 2.2.5 TA克隆
• 2.2.6 阳性克隆的筛选
• 2.2.7 序列测定与分析
• 2.2.8 GPAT全长序列的鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 新疆沙冬青GPAT基因的克隆
• 2.3.2 新疆沙冬青GPAT基因的序列分析
• 2.3.3 新疆沙冬青GPAT基因的同源性比对及分子进化分析
• 2.4 讨论
• 第三章 ICE基因的克隆及序列分析
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 植物基因组DNA的提取
• 3.1.2 同源片段的扩增和克隆
• 3.1.3 3' RACE
• 3.1.4 染色体步移获得5'片段
• 3.1.5 DNA序列测定与分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 新疆沙冬青ICE基因的克隆
• 3.2.2 新疆沙冬青ICEa、ICEb基因的序列分析
• 3.2.3 AnICEa、AnICEb基因的同源性和进化分析
• 3.3 讨论
• 第四章 新疆沙冬青AnGPAT基因的原核表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种和载体
• 4.1.2 酶和试剂
• 4.1.3 pET30a-GPAT原核表达载体的构建及转化
• 4.1.4 AnGPAT蛋白原核表达
• 4.1.5 SDS-PAGE电泳分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 pET30a-GPAT重组质粒的酶切鉴定
• 4.2.2 重组质粒pET30a-AnGPAT在BL21（DE3）中的诱导表达
• 4.3 讨论
• 第五章 AnGPAT真核表达载体的构建
• 5.1 研究材料
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 主要的酶试剂及试剂盒
• 5.1.3 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 实验方案设计
• 5.2.2 AnGPAT的获得
• 5.2.3 CaMV 35S-GUS-NOS片段的克隆
• 5.2.4 中间载体pGM-35S-GPAT-NOS的构建
• 5.2.5 表达载体p2300-35S-GPAT-NOS的构建
• 5.2.6 农杆菌的转化
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 AnGPAT基因和CaMV 35S-GUS-NOS片段的克隆
• 5.3.2 中间载体pGM-35S-GPAT-NOS的构建
• 5.3.3 表达载体p2300-35S-GPAT-NOS的构建
• 5.3.4 转化子的鉴定
• 5.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表文章
• 致谢