论文摘要
系统性红斑狼疮（SLE）是一种病变累及多系统、多器官,严重危害人类健康的自身免疫性疾病,其特点是T、B淋巴细胞异常过度活化,从而引发大量自身抗体的产生和免疫复合物的沉积。目前导致SLE发生、发展的分子机制尚未明确,但近年来研究表明,表观遗传机制在SLE的发病机制中起着重要作用。表观遗传学修饰是一种不改变DNA序列,可逆的、可遗传的调节基因表达的机制。其机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和microRNA的调控等。近年来,学者们鉴定出了一系列组蛋白乙酰化和甲基化修饰位点,不同修饰的组合形式,可以影响染色质结构,改变转录因子与DNA相结合的能力,动态的调控基因转录功能。目前关于SLE的表观遗传学研究多集中于DNA甲基化上,而关于组蛋白修饰在SLE发病机制中的作用研究非常有限。E4BP4也被称为NFIL3,是一个具有碱性亮氨酸拉链（bZIP）结构的转录因子,糖皮质激素可以通过调节细胞内Ca2+浓度（[Ca2+] i）上升诱导E4BP4表达上调。已有研究发现E4BP4参与调节一些免疫细胞谱系的发育和功能,还可以调节B细胞的IgE类转换、T细胞极化反应和细胞因子的表达。至目前为止,E4BP4在免疫失调和自身免疫性疾病的作用仍不清楚。本课题组前期在转录因子活性谱芯片中发现SLE患者和正常对照CD4+T细胞比较,E4BP4的转录活性增加。因此,我们推测E4BP4可能在SLE发病过程中起到重要作用。本研究将通过三个部分来证实E4BP4在SLE发病过程中的作用机理。第一部分：检测活动性SLE患者,尤其是使用糖皮质激素（GC）治疗的患者中CD4+T细胞E4BP4表达。第二部分：研究E4BP4在SLE发病中的作用：（1）在用抗CD3/CD28抗体刺激的正常CD4+T细胞中过表达E4BP4,检测E4BP4对CD69、CD70、CD40L和CDlla等T细胞自身反应性分子和自身抗体IgG产量的影响；（2）在SLE患者CD4+T细胞中抑制E4BP4基因表达,对T细胞自身反应性和自身抗体IgG产量的影响。第三部分：研究E4BP4调控CD4+T细胞中潜在靶基因CD40L表达机制：（1）通过预测,发现CD40L可能是E4BP4调控的靶基因,检测E4BP4与CD40L启动子区域结合情况,分析活动性SLE患者CD4+T细胞CD40L表达水平与E4BP4蛋白表达的关系；（2）使用ChIP和Real-time PCR检测E4BP4对CD40L启动子区域组蛋白乙酰化和甲基化修饰作用。通过这些研究揭示E4BP4过表达在SLE发生、发展中所发挥的作用及其对下游潜在靶基因表观遗传调控机制,为SLE的治疗寻找新的有效途径提供理论依据。第一章SLE患者CD4+T细胞E4BP4表达目的：检测SLE患者CD4+T细胞中E4BP4表达水平及其与疾病状态的关系。方法：采用密度梯度法分离正常对照、未使用糖皮质激素（GC）治疗SLE患者和使用GC治疗患者各15例的外周血单个核细胞,免疫磁珠分选CD4+T细胞,Real-time PCR、Western blot的方法分别从mRNA及蛋白水平检测E4BP4的表达,并分析E4BP4与疾病活动性评分（SLEDAI）的相关性。结果：和正常人比较,未使用和使用GC治疗的SLE患者CD4+T细胞E4BP4mRNA水平均升高（未使用GC:P<0.01,使用GC:P<0.01）,其中使用GC治疗组较未使用GC组E4BP4mRNA表达显著升高（P<0.01）。和正常人比较,未使用和使用GC治疗的SLE患者CD4+T细胞E4BP4蛋白水平也均升高（未使用GC:P<0.05,使用GC:P<0.01）,其中使用GC治疗组较未使用GC组E4BP4蛋白表达显著升高（P<0.01）。未使用GC和使用GC治疗的SLE患者CD4+T细胞E4BP4蛋白水平和SLEDAI评分呈显著负相关（未使用GC:R=-0.771,P=0.001；使用GC:R=-0.607, P=0.0017）结论：SLE患者CD4+T细胞中E4BP4表达明显上调,糖皮质激素可诱导E4BP4在CD4+T细胞中的表达增加,且E4BP4与疾病活动性呈负关联。第二章E4BP4表达异常与自身免疫反应关系的研究第一节过表达E4BP4抑制CD4+T细胞活化及自身免疫反应目的：研究E4BP4过表达能否抑制抗CD3/CD28抗体诱导正常CD4+T细胞的活化及自身免疫反应。方法：采用密度梯度离心法分离3名正常人的外周血单个核细胞,免疫磁珠分选CD4+T细胞和CD19+B细胞。抗CD3/CD28抗体活化CD4+T细胞后,使用电穿孔法将pcDNA3.1-E4BP4表达质粒及pcDNA3.1对照质粒瞬时转染CD4+T细胞,采用Western blot检测E4BP4蛋白表达水平,流式细胞仪检测转染12小时CD69蛋白的表达情况,使用Real-time PCR和流式细胞仪检测转染36小时CD70、CD40L、CD11a mRNA和蛋白的表达量,ELISA法检测自身B细胞IgG抗体表达水平。结果：转染E4BP4表达质粒至抗CD3/CD28抗体活化后的CD4+T细胞后,E4BP4蛋白表达显著上调（P<0.01）, CD69蛋白表达明显受到抑制（P<0.01）,CD40L mRNA（P<0.01）和CD40L蛋白（P<0.05）表达均显著下降,而CD70、CD11a mRNA和蛋白的表达则无差异,自身抗体IgG的表达水平明显下降（P<0.01）。结论：E4BP4过表达抑制CD4+T细胞活化及自身免疫反应。第二节下调E4BP4表达加重SLE患者CD4+T细胞自身免疫反应目的：探讨抑制E4BP4表达是否导致SLE患者CD4+T细胞自身免疫反应加重。方法：采用密度梯度离心法分离3名活动性SLE患者的外周血单个核细胞,免疫磁珠分选CD4+T细胞和CD19+B细胞,设计3对针对E4BP4的siRNA和对照siRNA,电穿孔法瞬时转染SLE患者的CD4+T细胞,采用Western blot检测E4BP4蛋白表达水平,Real-timePCR和流式细胞仪检测CD70、CD40L、CDlla mRN和蛋白表达水平。ELISA法检测自身B细胞IgG抗体表达水平。结果：转染E4BP4-siRNA-3与对照siRANA相比,SLE患者CD4+T细胞中E4BP4蛋白表达受到明显抑制（P<0.01）。抑制E4BP4表达的SLE患者CD4+T细胞CD40LmRNA（P<0.01）和蛋白（P<0.05）的表达量显著增加,而CD70、CD11a mRNA和蛋白的表达则无差异。自身抗体IgG的表达水平明显上升（P<0.01）。结论：抑制SLE患者CD4+T细胞中E4BP4表达,可上调CD40L表达,加重CD4+T细胞自身反应性,刺激B细胞活化产生更多的自身抗体。第三章E4BP4调控CD4+T细胞CD40L表达及其分子机制第一节CD4+T细胞中CD40L为E4BP4调控的靶基因的预测与鉴定目的：研究CD4+T细胞中CD40L是否为E4BP4调控的靶基因。方法：使用Mat-Inspector软件预测CD40L启动子区域（上游-2000bp到转录起始位点左右）是否有E4BP4的结合位点。采用密度梯度离心法分离3名正常人的外周血单个核细胞,免疫磁珠分选CD4+T细胞,使用电穿孔法将pcDNA3.1-E4BP4表达质粒及pcDNA3.1对照质粒瞬时转染CD4+T细胞,使用免疫共沉淀ChIP-PCR检测E4BP4是否与CD40L启动子区结合。使用Real-time PCR检测第一部分标本SLE患者CD4+T细胞中CD40L mRNA表达水平并分析其与E4BP4相关性。结果：Mat-Inspector软件预测到CD40L启动子区域存在E4BP4的结合位点。ChIP-PCR证实了E4BP4可与CD40L启动子区结合。未使用GC和使用GC治疗的SLE患者CD4+T细胞和正常对照相比CD40L mRNA表达上调（未使用GC：P<0.01,使用GC：P<0.05）,其中使用GC治疗患者CD40L表达较未使用GC治疗患者表达显著降低（P<0.05）,且CD40L mRNA水平与E4BP4蛋白水平呈负相关（R=0.758,P=0.001）。结论：CD40L可能为E4BP4调控的靶基因。E4BP4可能通过抑制CD40L的表达使SLE患者CD4+T细胞的自身免疫反应降低。E4BP4在SLE发病中可能是一个保护性分子。第二节E4BP4对CD40L启动子区域组蛋白乙酰化及甲基化修饰的调控目的：研究过表达E4BP4对CD4+T细胞的CD40L启动子区域组蛋白修饰状态的调控作用。方法：针对CD40L启动子区域可能的E4BP4结合位点设计了3对引物,使用ChIP结合Real-time PCR检测CD40L启动子区不同潜在结合靶点组蛋白H3乙酰化和甲基化水平。结果：过表达E4BP4的CD4+T细胞CD40L启动子区潜在靶点2区域（启动子上游-200bp左右）组蛋白H3K9乙酰化（P<0.05）、H3K14乙酰化（P<0.05）和H3K4三甲基化（P<0.05）降低,而同区域的组蛋白H3K9三甲基化上升（P<0.05）。结论：E4BP4通过对CD40L启动子区域组蛋白H3乙酰化及甲基化修饰调控CD40L基因的表达。
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相关论文文献
- [1].DBP及E4BP4对拓扑异构酶Ⅰ的转录调节作用[J]. 山西医科大学学报 2012(06)