乳酸菌Lactococcus Lactis SYFS1.009生物法制备γ-氨基丁酸的研究

论文摘要

γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸,在哺乳动物体内GABA是一种抑制性神经递质,介导40%以上的抑制性神经信号。GABA具有提高脑活力、营养神经、降低血压,安定精神、改善肝肾机能等功能,因而它在功能食品中具有广泛的应用前景。本论文首先进行了乳酸菌Lactococcus lactis subsp. lactis SYFS1.009补料分批发酵制备GABA的研究,并在此基础上进行了200L扩大化实验。随后研究了乳酸菌细胞转化法制备GABA的工艺,同时探讨了外源辅酶及缓冲盐对细胞转化的影响,建立起产物生成动力学模型用于预测和指导实际生产。底物分批添加是指在反应过程中间歇地添加底物,使目标产物GABA在发酵液中得到不断积累,从而提高底物的利用率,解决了发酵液中L-谷氨酸与GABA分离困难的问题。实验通过流加6mol/L的NaOH控制发酵pH在5.0,同时间歇补加葡萄糖和L-MSG,谷氨酸钠补加3次后发酵110h,发酵液中GABA的含量达5.41g/L,L-谷氨酸剩余0.68g/L,利用率达94.5%,GABA得率为29.6%。200L扩大化实验的结果表明,补料分批发酵在小试的基础上是可以放大运用的。GABA产品纯度为53%,水分8.6%,灰份1.8%。经过多次重复实验GABA产量稳定,为工业化大规模生产奠定了较好的基础。研究了乳酸菌细胞转化法制备GABA的工艺,分别讨论了菌体浓度、底物浓度、菌龄、缓冲液种类、温度、pH等因素对产量的影响。在单因素的基础上,采用正交设计进行优化,综合实际生产得到的最优条件为:菌龄12h,菌体浓度10g/L,L-MSG浓度10g/L,酶转化在45oC,0.2mol/L、pH4.2的醋酸缓冲液（内含0.1mmol/LPLP）中进行,15h反应。在此条件下菌体可重复利用四次。探讨了辅酶在细胞转化过程中的影响。通过测定酶反应动力学常数的变化,发现外源辅酶主要改变了表观米氏常数,Km值从22.95mmol/L减小到4.65mmol/L,但对最大反应速率的影响不大。所使用的缓冲液除维持体系pH值外,对稳定酶蛋白结构防止辅酶脱落可能也起到一定的作用。在大量实验基础上通过计算机拟和出产物生成动力学模型为:P=[6×10-4（E02S0）+2.204][1-exp（-0.282t）],该模型在一定程度上可用于指导和预测实际生产。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 非蛋白氨基酸
• 1.2 γ-氨基丁酸的理化性质及结构
• 1.3 γ-氨基丁酸的生理功能
• 1.3.1 在植物中的功能
• 1.3.2 在动物中的功能
• 1.4 谷氨酸脱羧酶概述
• 1.5 GABA 的天然存在和制备
• 1.5.1 GABA 的天然分布和积累
• 1.5.2 GABA 的制备方法
• 1.6 立题背景
• 1.7 本课题研究内容
• 第二章 控制 pH 补料分批发酵的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 菌种及保藏方法
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 主要实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 Lc.lactis SYFS1.009 生物合成 GABA 的过程
• 2.3.2 控制pH 补加葡萄糖发酵的研究
• 2.3.3 L-谷氨酸钠间歇分批添加的研究
• 2.3.4 谷氨酸钠间歇分批添加底物利用率及GABA 得率计算
• 2.3.5 200L 扩大化发酵实验
• 2.3.6 产品成分分析
• 2.4 本章小节
• 第三章 乳酸菌细胞转化法制备GABA 的工艺研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 菌体浓度对GABA 产量的影响
• 3.3.2 底物浓度对GABA 产量影响
• 3.3.3 不同缓冲体系对GABA 产量的影响
• 3.3.4 pH 对GABA 产量的影响
• 3.3.5 转化时间的影响
• 3.3.6 体系温度对产量的影响
• 3.3.7 菌龄对GABA 产量的影响
• 3.3.8 PLP 的添加量对产量的影响
• 3.4 正交实验确定最佳酶反应条件
• 3.5 菌体生产能力指标
• 3.6 本章小节
• 第四章 外源辅酶及缓冲盐对细胞转化的影响及产物生成动力学模型研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 菌种
• 4.2.4 培养基
• 4.2.5 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 辅酶在反应过程中的稳定性
• 4.3.2 外源辅酶对反应动力学常数的影响
• 4.3.3 体系里的缓冲盐对反应的影响
• 4.3.4 细胞转化过程中GABA 变化
• 4.3.5 细胞转化生成GABA 动力学模型探讨
• 4.3.6 动力学模型验证
• 4.4 本章小节
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文