论文摘要
第一部分重组基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF—β1-RFP的构建【目的】构建重组基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF—β1-RFP,为基因转染提供目的基因。【方法】载体PLNCX2经XhoⅠ/HindⅢ双酶切,去磷酸化后,与载体pCDNA3.1-GFP（-）经XhoⅠ/HindⅢ双酶切得到的多克隆位点和GFP基因在T4DNA连接酶的作用下连接,构建成PLNCX2-GFP。Ⅱ-1Ra基因从正常人脑组织cDNA文库中扩增,胶回收,经XhoⅠ/BamHⅢ双酶切后,与经XhoⅠ/BamHⅢ双酶切的PLNCX2-GFP,在T4DNA连接酶的作用下连接,构建成PLNCX2-I1-1Ra-GFP。载体经PLNCX2HindⅢ/NotⅠ双酶切,去磷酸化后,与载体pDsRed2经HindⅢ/NotⅠ双酶切得到大的部分多克隆位点和RFP基因在T4DNA连接酶作用下连接,构建成PLNCX2-RFP。TGF-β1基因从PGEMT-TGF中扩增,胶回收,经XhoⅠ/HindⅢ双酶切后,与经XhoⅠ/HindⅢ双酶切的PLNCX2-RFP在T4DNA连接酶作用下连接,构建成PLNCX2-TG-β1-RFP。【结果】重组基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP经酶切鉴定测序I1-1Ra、TGF-β1、RFP、GFP序列均正确,基因可以通读;并且经酶切电泳后,其条带位置与相应的质粒图谱相符。【结论】本实验构建的逆转录病毒重组基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP是正确的。第二部分重组基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF—β1-RFP的病毒包装和滴度测定【目的】提高逆转录病毒载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF—β1-RFP的转染效率,并测定用于转染的最佳病毒滴度。【方法】包装细胞PT67生长至80%融合时,脂质体介导转染法分别将重组质粒PLNCX2-I1-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP转染PT67,具体操作方法见真核细胞LipofectAMINE2000Reagent转染试剂盒,用G418筛选培养14d,待转染细胞形成抗性克隆后挑选出扩增培养、传代、收集各克隆1～4代的病毒上清,过滤后分装—70冻存。取6孔培养板,每孔加入2×104个NIH3T3细胞株,细胞生长至80%融合时,加入1:100稀释的各阳性克隆病毒液3ml,培养4h后换用300μg/ml的G418筛选液培养4周,计数存活的抗性克隆,根据公式计算病毒上清滴度。【结果】转染到包装细胞后,可分别看到绿色和红色荧光;转染NIH3T3细胞后计算病毒滴渡为1×106C.F.U;【结论】得到具有高转染效率的重组基因,并获得最佳的转染病毒滴度。第三部分重组基因PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF—β1-RFP体外转染兔膝关节软骨细胞对其生物学性状的影响及其目的基因表达情况的研究【目的】探讨运用重组逆转录病毒载体介导白介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）和转化生长因子-β1（TGF-β1）,分别和共同体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其在关节软骨细胞中的表达情况。【方法】将构建含有目的基因的表达载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP,分别和联合体外转染到兔膝关节软骨细胞,采用NO检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,及ELISA法检测细胞培养上清液中hIL-1Ra和hTGF-β1的表达情况。【结果】酶切和测序表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX2-IL-1Ra-GFP和PLNCX2-TGF-β1-RFP;稳定转染软骨细胞后免疫荧光倒置显微镜分别观察到绿色和红色荧光,共转染组同一细胞可见绿色和红色荧光,证明转染成功;培养液中NO含量检测发现单基因转染和联合转染分别为（92.15±5.36）vmol/L、（89.71±5.43）Vmol/L、（94.93±4.88）μmol/L,空载体组和空白组分别为（60.19±4.68）μmol/L、（57.23±4.29）μmol/L,基因转染组间无统计学意义（P＞0.05）,非基因转染组间无统计学意义,基因转染组与非基因转染组间有统计学意义（P＜0.05）;ELISA检测发现基因转染组均有相应的一定量的hIL-1Ra和hTGF-β1表达,单基因转染组分别为（43.42±4.07）ng/L、（28.08±3.73）ng/L,联合转染组分别为（46.55±4.85）ng/L、（30.79±3.14）ng/L,未转染组与空载体组均无基因表达,基因转染组与非基因转染组间比较有统计学意义（P＜0.05）,而单基因转染组和联合转染组间差异无统计学意义（P＞0.05）。【结论】逆转录病毒载体PLNCX2介导的IL-1Ra和TGF-β1能有效的分别和共同转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,为目的基因IL-1Ra和TGF-β1单独和联合转染治疗骨关节炎提供了理论基础。
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