论文摘要
心房纤颤（简称房颤）是最常见的心律紊乱之一,其特点为心房出现不规律的快速心电活动,同时伴心房肌收缩能力受损。房颤在临床上具有持久性倾向,表现为房颤持续时间越长,转复并维持窦性心律越困难,以致大部分阵发性房颤病人最终都发展为慢性房颤。慢性房颤易引起心、脑栓塞等严重并发症危及患者生命。目前对房颤的治疗越来越重视,但是至今仍缺乏有效的手段,其根本原因在于房颤发生的机制尚不清楚。尽管房颤的发生发展机制尚未彻底揭示,但经过不断的探索,近年来研究已经证实:房颤心房肌出现电生理重构和结构重构,是房颤发生发展和难以逆转的原因。电生理重构主要表现为心房肌L型钙通道电流(快速内向钙离子电流,Ica.L)降低,动作电位有效不应期缩短。结构重构包括心肌肥厚、溶解、糖原堆积、肌浆网断裂、纤维增生、染色质聚集及线粒体改变等。L型钙通道电流（Ica,L）是动作电位平台期的主要成分,在快速心电刺激下明显降低,导致心房肌有效不应期缩短,有利于心房内多个兴奋折返波的形成。心房肌Ica,L降低是房颤主要的电生理重构现象。利用膜片钳技术观察房颤心房肌L型钙通道的电生理特性改变,发现房颤和窦性心律的心房肌细胞L型钙通道的电生理特性基本相同,所以L型钙通道表达降低被认为是房颤心房肌Ica.L降低的分子基础。但是目前已报告的实验结果相互矛盾,Kamp发表述评,推测缘于病例采集标准、取材部位、实验方法及人与动物的心房肌电重构进度不同等。作者通过对相关文献的检索和分析,推测房颤心房肌L型钙通道电重构的分子基础与αlc亚单位的亚型表达改变有关。结构重构的发生,是房颤心房肌收缩功能和心电活动较难恢复正常的重要原因。曾经认为房颤心房肌结构重构是退变和凋亡的过程,最近Ausma等发现房颤心房肌出现胚胎心房肌的表现,一些在成熟心房肌表达消失的胚胎心肌特征性蛋白,如α平滑肌肌动蛋白（α-SM actin）和β-肌球蛋白重链（β-MHC）,重新表达在房颤心房肌中,成熟心肌中正常表达的Titin蛋白、肌浆网相关蛋白cardiotin及结蛋白消失,证实房颤心房肌存在反分化改变。心房肌的反分化是房颤心房肌为生存而出现的适应性改变。这种程序性生存改变被认为是心房肌在房颤状态下病理生理改变的本质。结构重构和电生理重构是房颤心房肌反分化改变的不同表现。房颤心房肌的蛋白分子表达改变类似于胚胎心肌发育基因的表达,使我们推测房颤心房肌重构和发育基因的表达调控两者存在一些共同的信号途径,导致心房肌在两种不同的生理状态具有一些相同的分子表现。转录激活因子Elk-1,作为ETS家族成员之一,在细胞分化调节中起着重要作用。因此有理由推测转录激活因子ELK-1参与调控房颤心房肌的分子和结构重构。基于以上分析,为了深入探讨房颤心房肌Ica.L降低的分子基础及转录激活因子Elk-1在调控房颤心房肌重构中的作用,我们进行了本课题研究,主要研究目标和结果如下:1.房颤心房肌L型钙通道α1c亚单位mRNA表达改变及意义:1)应用RT-PCR技术检测慢性房颤患者心房肌L型钙通道α1c亚单位不同位置的PCR扩增片段表达改变。结果显示:1)亚单位Ⅰ-Ⅱ跨膜区连接对应的mRNA丰度,慢性房颤心房肌与窦性心律心房肌无明显差异;2)α1c亚单位Ⅳ跨膜区对应的mRNA丰度,慢性房颤心房肌较窦性心律心房肌明显降低。实验结果表明房颤心房肌L型钙通道的离子重构与αlc亚单位的亚型表达改变有关。2)为了阐明房颤心房肌L型钙通道α1c亚单位编码基因不同位置扩增片段表达变化的不同,我们结合GENE BANK数据对两个区域的PCR扩增片段做了进一步的分析,探讨了房颤心房肌αL1c亚单位在Ⅰ-Ⅱ跨膜区连接和Ⅳ跨膜区的衔接亚型与α1c亚单位重构的关系。结果显示:1)房颤心房肌L型钙通道α1c亚单位Ⅰ-Ⅱ跨膜区连接主要是EXON（12+15+17+20）的衔接亚型,未扩增到EXON（12+15+16+17+20）的衔接亚型;同时发现该对引物不能扩增EXON14插入的衔接亚型;2)房颤心房肌L型钙通道α1c亚单位Ⅳ跨膜区扩增产物包括此区域所有三种衔接亚型。结果表明房颤心房肌L型钙通道α1c亚单位编码基因包含多种衔接亚型,且存在表达降低的亚型,从而构成房颤电生理重构的分子基础。3)为了进一步确定房颤心房肌L型钙通道α1c亚单位的亚型类型,及深入研究房颤心房肌L型钙通道α1c亚单位的转录调控机制,我们鉴定了房颤心房肌中不同转录起始位点的L型钙通道α1c亚单位。结果表明房颤心房肌存在两种不同转录起始位点的L型钙通道α1c亚单位,同时提示房颤心房肌L型钙通道α1c亚单位的表达改变受到两种不同的启动子调控。2.转录激活因子Elk-1及MEK/ERK途径信号分子在房颤心房肌的表达改变及其意义1)为了探讨转录激活因子ELK-1在调控房颤心房肌重构中的作用,本课题采用Westem blot技术检测慢性房颤患者心房肌ELK-1的表达改变,并采用免疫组化和间接免疫荧光技术比较慢性房颤与窦性心律心房肌ELK-1表达和分布。结果显示:1)Westem blot证明ELK-1蛋白在房颤心房肌中表达较在窦性心律心房肌中表达明显降低;2)免疫组化显示ELK-1主要表达在窦性心律心房肌胞浆和胞核,慢性房颤心房肌表达较弱;3)间接免疫荧光技术显示ELK-1在窦性心律心房肌细胞核表达相对较高,在房颤心房肌细胞核中表达明显受到抑制、p-ELK-1在房颤心房肌、窦性心律心房肌均表达受抑。结果表明转录激活因子ELK-1在房颤心房肌表达明显降低,因此Elk-1可能在房颤心房肌电重构和结构重构发生中发挥着关键的作用。2)为了探讨转录激活因子ELK-1活化依赖的MEK/ERK信号传导途径在慢性房颤心房肌重构中的作用,我们比较了慢性房颤心房肌和窦性心律心房肌中信号分子MEK、ERK及p-ERK的蛋白表达差异。结果显示信号分子MEK和ERK及p-ERK的蛋白表达,慢性房颤病人心房肌与窦性心律心房肌无明显差异。因此,房颤心房肌经MEK/ERK途径传导刺激信号的能力并没有减弱,但由于转录激活因子ELK-1在房颤心房肌的表达下调,信号传递并调控DNA上转录反应元件的效应减弱。3)为了进一步探讨转录激活因子ELK-1在慢性房颤心房肌电重构中的作用,我们应用生物信息学的手段预测了ELK-1对心房肌L型钙通道α1c亚单位表达的调控作用。L型钙通道α1c亚单位编码基因CACNAlC外显子exonlb的5’侧翼启动子区域包括相互邻近的ELK-1和SRF结合位点,而exonla的5’侧翼启动子区域仅包括ELK-1结合位点。因此,转录因子ELK-1对心房肌CACNAlC基因exonlb前的启动子起激活作用,而对exonla前的启动子起抑制作用。尽管预测尚需进一步的实验支持,生物信息学的证据仍提示了转录激活因子ELK-1对心房肌L型钙通道α1c亚单位表达的调控作用。综上所述,本课题研究了慢性房颤患者心房肌电生理重构的分子基础及转录激活因子ELK-1在慢性房颤发病机制中的作用。首先,我们的结果表明房颤心房肌Ica,L降低的分子机制是L型钙通道α1c亚单位表达降低,α1c亚单位的亚型表达改变构成房颤心房肌L型钙通道离子重构的基础。其次,到目前为止,我们在国内外首次观察到转录激活因子ELK-1在房颤心房肌表达明显降低。磷酸化的转录激活因子ELK-1通过与转录因子SRF相互作用激活靶基因的转录,同时非磷酸化的转录激活因子ELK-1通过多种方式抑制基因的转录,房颤心房肌转录激活因子ELK-1表达降低,势必引起一系列基因表达的协同改变。我们的结果提示转录激活因子ELK-1的表达下调可能在慢性房颤心房肌的分子重构中起着重要的作用。
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