论文题目: 鸡钙代谢调节相关基因的克隆重组与表达研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖
作者: 章世元
导师: 杨利国
关键词: 钙代谢调节物,基因克隆,真核表达质粒构建,基因表达
文献来源: 南京农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究以新扬州鸡为研究对象,根据已发表的基因序列设计引物,利用逆转录多聚酶链反应等分子生物学技术进行了新扬州鸡降钙素、甲状旁腺激素和D28k钙结合蛋白等三个主要钙代谢调节物基因cDNA的扩增与真核表达质粒的构建,并通过腿部肌肉注射导入构建质粒,测定血清中降钙素、甲状旁腺激素、雌二醇浓度及血钙、血磷的浓度,以观察真核表达质粒在鸡体内的表达效果,不仅为今后从事鸡体内钙营养代谢调控机制的研究提供了必要的物质条件与技术手段,同时也为鸡育种过程中钙代谢调节相关基因研究及应用基因增强疗法治疗鸡钙代谢性疾病提供了重要的基础材料。 1.钙代谢调节相关基因的克隆与测序 将取自四只450日龄新扬州鸡的新鲜鳃后腺、甲状旁腺和小肠粘膜上皮组织提取总RNA后,利用新设计的引物通过逆转录多聚酶链反应进行扩增,并对扩增得到的产物进行了酶切鉴定与序列分析。结果: ①用SV Total RNA Isolation System从前述三个组织样品中提取得到了总RNA,以此为模板,用本研究设计的引物通过RT-PCR扩增得到降钙素基因417bp、甲状旁腺素基因360bp和D28k钙结合蛋白基因800bp三个片段。 ②将得到的基因cDNA分别导入pGEM-T载体、PCR鉴定、测序,将序列分析的结果利用Blast程序与已发表的核苷酸序列进行比对。结果表明:本研究扩增得到的新扬州鸡降钙素cDNA核苷酸序列中仅有一个碱基与目前已发表的鸡降钙素基因cDNA不同;甲状旁腺激素基因cDNA则与GenBank记录鸡甲状旁腺激素基因完全一致;D28k钙结合蛋白基因cDNA与已发表的核苷酸序列也有一个碱基的差别。 ③根据核苷酸序列分析结果推导出的氨基酸序列结果表明:新扬州鸡降钙素及甲状旁腺激素的氨基酸序列与已发表的鸡相应激素的氨基酸序列完全一致,并没有因为降钙素基因cDNA核苷酸序列中一个碱基的差异而带来降钙素氨基酸序列的改变。但D28k钙结合蛋白却因+760处的G转换成了T,相应的引起了第252位的缬氨酸转变为了色氨酸。 ④三个物质氨基酸序列的动物种属同源性比较结果为:在所列10种降钙素的氨基酸序列中,不同种属间氨基酸的保守序列所占比例为75%。本研究扩增得到的降钙
论文目录:
摘要
ABSTRAC
前言
第一部分 文献综述
1 钙代谢调控研究进展
1.1 研究动物体内钙代谢调控的意义
1.1.1 促进营养学科的发展
1.1.2 为动物遗传育种提供新的研究方向
1.1.3 提高动物的繁殖力
1.1.4 有利于疾病控制技术的研究
1.2 钙代谢的整体调节
1.2.1 钙代谢的营养生理调节
1.2.1.1 食物及消化道因素对钙代谢的影响
1.2.1.2 维生素D与钙代谢间的关系
1.2.2 钙代谢的内分泌调控
1.2.2.1 PTH与钙代谢
1.2.2.2 CT与钙代谢
1.2.2.3 性激素与钙代谢
1.2.3 影响钙代谢的其它因素
1.3 钙代谢的基因调控
1.4 本章小结
参考文献：
2 基因治疗及其在骨钙代谢性疾病防治中的应用
2.1 基因治疗的概念与分类
2.1.1 基因治疗
2.1.2 基因治疗的分类
2.1.2.1 基因矫正
2.1.2.2 基因置换
2.1.2.3 基因增强
2.1.2.4 基因调节
2.2 基因治疗技术研究内容与应用前景
2.2.1 研究内容
2.2.1.1 基因导入技术
2.2.1.2 治疗基因运送载体的研究
2.2.1.3 基因治疗靶细胞的选择
2.2.1.4 基因治疗的靶向性
2.2.2 基因治疗的临床应用前景
2.3 基因治疗在骨科疾病防治中的应用
2.3.1 骨愈合的基因治疗
2.3.2 关节和软骨的基因治疗
2.3.3 椎间盘疾病的基因治疗
2.3.4 肌键和韧带的基因治疗
2.3.5 骨钙代谢性疾病的基因治疗
2.4 本章小结
参考文献
第二部分 实验研究
3 鸡钙代谢调节相关基因的克隆与测序
3.1 实验一：降钙素基因的克隆与序列分析
3.1.1 材料与方法
3.1.1.1 材料
3.1.1.2 方法
3.1.2 实验结果与分析
3.1.2.1 总RNA提取结果
3.1.2.2 应用RT-PCR扩增cCT基因
3.1.2.3 重组体的筛选
3.1.2.4 测序结果
3.1.2.5 同源性比较
3.1.2.6 种属间比较
3.1.3 讨论
3.2 实验二：甲状旁腺激素基因的克隆与序列分析
3.2.1 材料与方法
3.2.1.1 材料
3.2.1.2 方法
3.2.2 结果与分析
3.2.2.1 总RNA提取结果
3.2.2.2 RT-PCR产物电泳分析
3.2.2.3 RT-PCR产物克隆
3.2.2.4 鸡甲状旁腺素cDNA序列分析
3.2.2.5 种属间PTH基因氨基酸序列分析
3.2.3 讨论
3.3 实验三：鸡CABP-D28K基因的克隆与序列分析
3.3.1 材料与方法
3.3.1.1 材料
3.3.1.2 方法
3.3.2 结果与分析
3.3.2.1 总RNA的提取
3.3.2.2 PCR产物电泳分析
3.3.2.3 PCR产物的克隆
3.3.2.4 测序结果
3.3.2.5 序列分析
3.3.2.6 种属间CaBP-D28k氨基酸同源性比较
3.3.2.7 种属CaBP-D28k进化树
3.3.2.8 种属CaBP-D28k氨基酸序列比较
3.3.3 讨论
3.4 本章小结
参考文献
4 鸡钙代谢调节相关基因真核表达质粒的构建
4.1 实验四鸡降钙素基因真核表达质粒的构建
4.1.1 材料与方法
4.1.1.1 材料
4.1.1.2 方法
4.1.2 结果与分析
4.1.2.1 重组真核表达质粒的筛选
4.1.2.2 重组真核表达质粒酶切结果
4.1.2.3 重组真核表达质粒的PCR鉴定
4.1.3 讨论
4.2 实验五：鸡甲状旁腺激素基因真核表达质粒的构建
4.2.1 材料与方法
4.2.1.1 材料
4.1.1.2 方法
4.2.2 结果
4.2.2.1 真核表达质粒pcDNA3-PTH构建鉴定
4.2.2.2 真核表达质粒pCEP4-PTH构建鉴定
4.2.3 讨论
4.3 实验六：鸡CABP-D28K重组真核表达质粒的构建
4.3.1 材料与方法
4.3.1.1 材料
4.3.1.2 方法
4.3.2 结果与分析
4.3.2.1 重组质粒的PCR鉴定
4.3.2.2 重组质粒的酶切分析
4.3.3 讨论
4.4 实验七：鸡CABP-D28K重组真核表达质粒的细胞表达
4.4.1 材料与方法
4.4.1.1 材料
4.4.1.2 重组质粒在COS-Ⅰ细胞中的表达方法
4.4.3 讨论
4.5 本章小结
参考文献
5 钙代谢调节相关基因真核表达质粒在蛋鸡体内的表达及其对钙代谢的调节
5.1 实验八：鸡降钙素CDNA在蛋鸡体内的表达
5.1.1 材料与方法
5.1.1.1 材料
5.1.1.2 方法
5.1.2 实验结果与分析
5.1.2.1 血清中降钙素水平的变化
5.1.2.2 重组降钙素基因质粒对甲状旁腺素分泌的影响
5.1.2.3 重组鸡降钙素基因质粒对雌激素分泌的影响
5.1.2.4 重组鸡降钙素基因对血清钙磷浓度的影响
5.1.3 讨论
5.1.3.1 蛋鸡体内主要钙代谢调节物浓度的变化
5.1.3.2 重组基因质粒的表达效果
5.2 实验九：鸡甲状旁腺激素基因CDNA在蛋鸡体内的表达
5.2.1 材料与方法
5.2.1.1 材料
5.2.1.2 方法
5.2.2 结果与分析
5.2.2.1 重组质粒对鸡血清中甲状旁腺激素浓度的影响
5.2.2.2 重组质粒对鸡血清降钙素浓度的影响
5.2.2.3 注射重组质粒对鸡血清雌二醇浓度的影响
5.2.2.4 不同质粒对鸡血清钙磷浓度的影响
5.2.3 讨论
5.2.3.1 影响导入基因表达效果的因素
5.2.3.2 本实验质粒在蛋鸡体内的表达效果
5.3 实验十：鸡CABP-D28K重组质粒在蛋鸡体内的表达
5.3.1 材料与方法
5.3.1.1 材料
5.3.1.2 实验方法
5.3.2 结果与分析
5.3.2.1 血清钙含量的变化
5.3.2.3 血清中PTH含量的变化
5.3.2.4 血清中CT含量的变化
5.3.2.5 血清中E2含量的变化
5.3.3 讨论
5.3.3.1 重组CaBP-D28k质粒对鸡钙代谢的影响
5.3.3.2 其他影响钙代谢因素的探讨
5.4 本章小结
参考文献
全文结论
创新
附录1：在读期间发表论文(著)和申请专利
附录2：基因测序图
致谢
发布时间: 2005-07-19
参考文献
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标签：钙代谢调节物论文; 基因克隆论文; 真核表达质粒构建论文; 基因表达论文;