论文摘要
妊娠是一种同种异体移植,受全身、局部免疫调节。成功妊娠反映母体对胚胎的免疫耐受；母体对胚胎抗原的免疫排斥则导致妊娠失败。揭示母-胎免疫耐受的确切机制,将对人类自然流产等妊娠疾患的防治具有重要意义。由于母胎免疫耐受是自然界免疫逃逸良好的生理性模型,对移植免疫学和肿瘤免疫学研究将产生积极推动作用。母-胎界面主要包括滋养细胞、蜕膜基质细胞、蜕膜腺上皮细胞以及蜕膜免疫细胞。多年来人们从不同角度研究母-胎界面发生的生物学事件,以阐述母-胎免疫调节机制,其中包括母-胎界面Th2型免疫优势,及调节性T细胞（Regulatory T helper cells, Treg）扩增及功能机制。透明质酸（Hyaluronan, hyaluronic acid, HA）不仅作为一种广泛存在的细胞外基质,而且通过与靶细胞表面受体CD44结合,向细胞内传递信号,参与多种体细胞的功能调节,如增殖,迁移,活化,分化,细胞与细胞、细胞与基质间的黏附等,还能促进多种细胞因子、趋化因子的分泌。我们研究发现人早孕期母-胎界面透明质酸大量积聚并表达其受体CD44,因此我们以此为切入点阐明其在母-胎免疫调节中的作用机制。第一部分透明质酸及其受体CD44在人早孕期母-胎界面的表达及其调节目的分析透明质酸及其受体CD44在母-胎界面的表达特征及妊娠激素对其调节作用。方法收集早孕期正常或不明原因自然流产的绒毛与蜕膜组织,采用免疫组织/细胞化学、Real Time RT PCR、ELISA法、聚丙烯酰胺凝胶电泳和流式细胞术检测母-胎界面HA、HA合成酶（Hyaluronan synthase, HAS）及其受体CD44的表达特征,并比较HA在正常早孕与流产之间的差别。各种浓度的妊娠相关激素对蜕膜基质细胞进行处理,检测其HAS表达和HA的分泌。结果免疫化学法分析显示,绒毛与蜕膜组织均表达HA和CD44。HA主要表达于胞浆和胞外基质；CD44表达于胞膜。HA主要由早孕蜕膜胞基质细胞（DSCs）和滋养细胞（Tros）分泌。1x106cells/ml/孔DSCs培养至72h时,分泌HA水平达1032.0±73.83ng/ml,1x106cells/ml/孔Tros分泌HA峰值达686.4±57.1ng/ml。正常早孕的HAS2转录水平、HA分泌水平和平均分子量明显高于自然流产组,提示HA参与人正常妊娠的维持。17β-E2、孕酮或β-hCG均能促进DSCs转录HAS2和分泌HA。结论人母-胎界面表达HA, DSCs是其主要来源,并高表达CD44；正常早孕HA分泌水平和平均分子量显著高于不明原因自然流产患者,妊娠激素显著促进HA的分泌。第二部分母-胎界面透明质酸对滋养细胞和蜕膜基质细胞生物学行为的调节作用目的研究HA对母-胎界面滋养细胞和蜕膜基质细胞增殖、凋亡和侵袭的调节作用及其信号转导机制。方法BrdU检测细胞增殖、Annexin V-FITC分析细胞凋亡、Transwell Matrigel侵袭法分别分析高、中、低分子量的HA对滋养细胞和蜕膜基质细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。In-cell western检测HA活化的胞内信号通路分子,相应的信号通路抑制剂阻断HA的活化效应。结果高分子量HA能促进DSCs的增殖,抑制其凋亡；而高、中分子量HA能促进Tros的增殖,抑制其凋亡。中分子量HA显示出比高分子量HA更强的促进Tros的侵袭效应。HA抑制肽和CD44中和性抗体能完全或部分阻断HA对DSCs和Tros的生物学功能的升调节作用。高分子量HA能活化PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路,PI3K/AKT抑制剂LY294002和MEK1/2抑制剂U0126阻断相应的信号通路可逆转HA对DSCs和Tros的生物学行为的升调节作用。结论高、中分子量HA能上调DSCs和Tros的生物学行为,表现为增殖能力增强,凋亡下降,且Tros侵袭能力增强,有利于维持正常妊娠。PI3K/AKT和MAPK/ERKl/2信号通路参与HA诱导的对DSCs和Tros的生物学行为的升调节作用。第三部分母-胎界面透明质酸诱导CD14+单核巨噬细胞免疫耐受目的探讨外源性HA及蜕膜基质细胞培养上清对CD14+单核巨噬细胞表型的调节作用。方法流式细胞术分析蜕膜各种免疫细胞CD44的表达水平。磁珠分选外周血和蜕膜局部CD14+单核巨噬细胞,经不同分子量的外源性HA及蜕膜基质细胞培养上清液对其诱导,流式细胞术分析CD14+单核巨噬细胞膜表面MHC-Ⅱ分子、协同刺激分子和胞内细胞因子的表达特征。结果在蜕膜免疫细胞中CD14+巨噬细胞和调节性T细胞高表达CD44。经HMW-HA和蜕膜基质细胞培养上清刺激后,外周血及蜕膜CD14+单核巨噬细胞CD80、CD86表达下降,PD-L1和PD-L2表达上调；但对HLA-DR和ICOS-L无显著影响；HA抑制肽和CD44中和性抗体可抵消HA对CD14+单核巨噬细胞的调节作用。HMW-HA促进CD14+单核细胞分泌IL-10和TGF-B1,而LMW-HA抑制对外周血CD14+单核细胞分泌IL-10和TGF-β1。正常蜕膜CD14+巨噬细胞较流产蜕膜CD14+巨噬细胞CD80、CD86表达水平下降,IL-12p40分泌减少,PD-L1和PD-L2上升,IL-10和TGF-β1水平增加。结论HMW-HA和蜕膜基质细胞培养上清可诱导CD14+单核巨噬细胞呈现免疫耐受表型。第四部分透明质酸通过训导单核巨噬细胞诱导naive CD4+T细胞向Th2及Treg细胞分化目的探讨HMW-HA及DCM训导的单核巨噬细胞诱导naive CD4+T细胞的分化。方法流式细胞术分析与同个体HMW-HA或DCM训导的单核巨噬细胞共培养5天后的naive CD4+T细胞膜协同刺激分子受体、胞内细胞因子和核转录因子的表达水平。结果HMW-HA和DCM训导的单核巨噬细胞诱导naive CD4+T细胞上调CTLA-4和PD-1的表达,但对CD28和ICOS无显著影响；上调Th2型细胞因子IL-4、IL-10和转录因子GATA-3的表达,下调Thl型细胞因子IFN-γ、TNF-α和转录因子T-bet的表达,母-胎局部呈Th2免疫偏移；且上调CD4+T细胞TGF-β1和Foxp3的表达,有利于Treg扩增和功能增强；但对ICD4+T细胞IL-17A无明显影响,对RORyt有下调趋势。结论HMW-HA和DCM训导的单核巨噬细胞诱导naive CD4+T细胞向Th2和Treg细胞分化,促进母-胎界面Th2型免疫优势和免疫耐受。小结母-胎界面蜕膜基质细胞和滋养细胞分泌HA以高分子量为主,并表达其受体CD44, HMW-HA和MMW-HA通过PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路上调滋养细胞和蜕膜基质细胞的生物学行为,有利于胚胎着床和胎盘形成。HMW-HA和蜕膜基质细胞培养上清能训导CD14+的单核巨噬细胞升调节负性协同刺激分子,降调节正性协同刺激分子,同时高分泌IL-10和TGF-P1,通过调控经典转录因子诱导同个体的naive CD4+T细胞向Th2和Treg亚群分化,维持正常妊娠所需的免疫微环境。这些结果提示,高水平和成熟状态的HA有利于维持正常妊娠,而低水平和HA的降解产物可能导致不明原因自然流产。