论文题目: 人神经母细胞瘤（NB-1）细胞株TTX-R钠通道的分子克隆和功能分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 药理学
作者: 欧绍武
导师: 李金鸣,龟山正树
关键词: 神经母细胞瘤,细胞培养,钠通道,基因,克隆,分子,全细胞膜片钳
文献来源: 中国医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的神经母细胞瘤（neuroblastoma）细胞通常在神经发育过程中来自于神经嵴,表达出与神经元相似的生化、药理和功能方面的特性。它提供了一个可以用来研究包括钠通道在内的离子通道在分化过程中的表达和调节的体外模型系统。对多种神经母细胞瘤细胞株电生理特性的研究显示,不同的细胞株之间其钠电流(INa)的幅度变化很大,另外,INa的电压依赖性激活和失活也不相同,这就提示不同的钠通道基因变构体在这些细胞株上表达。人神经母细胞瘤细胞株（NB-1）由Miyaki等于1973年在日本建立,已被证实在幼稚型和成熟型NB-1细胞上表达电压依赖型钠通道和钾通道,因此NB-1细胞提供了一个可以研究钠通道在分化期间或对生物信号发生反应时的表达和调节的实用模型系统。我们以前的研究显示,NB-1细胞的钠通道包括河豚毒敏感型（TTX-S）和河豚毒不敏感型（TTX-R）两种成分,说明NB-1细胞表达了多种钠通道基因,然而这些钠通道的分子特性目前未知。有报道证实鼠神经母细胞瘤细胞株（B104细胞）的TTX-R钠通道表达出与鼠心肌（rH1）一致的基因类型,而人心肌TTX-R钠通道（hH1）是心肌的主要钠通道,负责工作心肌和传导系统的兴奋和收缩时大量的内向电流的产生,其突变型导致心律失常综合症。那么人NB-1细胞的TTX-R钠通道是否与hH1的基因型一致?作为一种神经系统肿瘤,其TTX-R钠通道基因表达有何特点?故本实验用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法对人NB-1细胞TTX-R电压依赖性钠通道α亚单位进行了克隆并使用全细胞膜片钳技术,对该通道的电生理特性进行分析,发现其基因序列与hH1的相似和不同之处,从基因水平找出该肿瘤的可能发生机制。方法将NB-1细胞在含有MEM的标准培养液中培养,传代2～3个周期后,使用RNeasy试剂盒提取NB-1细胞总RNA。第一链cDNA使用Sen-siscript Reverse Transcriptase试剂盒和Oligo（dt）或Random引物合成。PCR引物根据已知Nav1.5钠通道α亚单位（登录号:M77235）的序列而设计,A1～A9等共9对,PCR反应的同时使用β-actin引物作为阳性对照。使用适当的限制性内切酶将此9个片段分别在有重叠的部分进行酶切,得到预期片段后,使用T4连接酶分别连接,直至形成完整的DNA序列。全序列cDNA被亚克隆至哺乳动物表达载体pcDNA3.1（+）。HEK-293细胞于35mm培养皿以1～5×105的密度在包含MEM、10%小牛血清、50U·mL-1青霉素、50μg·mL-1链霉素和2mmol L-谷氨酸的培养液中培养。2μg亚克隆于pcDNA3.1（+）的本实验克隆的cDNA质粒,用TransfastTM转染试剂盒转染至HEK-293细胞,同时转染1μg pEG-FP-F以便行膜片钳时通过GFP荧光分辨转染细胞。成功转染的HEK-293细胞,可通过荧光显微镜予以区分,进行全细胞记录电压依赖性钠电流(INa)。所有的电生理记录均使用全细胞膜片钳技术,在配有CEZ2300放大器和反转显微镜的工作台上室温下完成。电极的电阻为3～8MΩ。钠电流从保持电位-120mV,5秒的刺激间期,除极至30mV（5mV的增幅）而激活。电流的采样速率为20KHz并存入电脑供数据分析。使用引物对A6进行半定量RT-PCR。该方法以竞争反应方式检测两个变构体在NB-1细胞上的相对表达数量。预期PCR产物条带的信号密度使用Quantity One 4.5软件分析。结果该克隆命名为hNbR1,其开放阅读框架（ORF）为2016个氨基酸残基,另外,一个删除了DⅡ～DⅢ之间第18外显子的选择性剪切体（hNbR1-2）被发现。半定量PCR分析的结果显示,hNbR1和hNbR1-2在35至45个PCR循环后,其DNA量无显著性差异,可以认为,在NB-1细胞中hNbR1和hNbR1-2的RNA各占50%。序列分析显示hNbR1与心肌Nav1.5/SCN5A氨基酸相似性达99.1%,并具有电压依赖性钠通道的结构特点:4个相似的跨膜结构域（DⅠ～DⅣ）,其中包括6个推定的α螺旋跨膜片段（S1～S6）,每个结构域的电压感受器跨膜片段（S4）均有正电荷残基;在DⅠ的P-环存在的半胱氨酸残基（C373）提示该通道为TTX-R钠通道。DⅠS3-S4之间一个位于第3号染色体的新的外显子（第6A外显子）编码了该通道α亚单位。在转染了hN-bR1和hNbR1-2的人胚肾细胞（HEK-293）上记录的钠电流的电生理特性与NB-1细胞本身的TTX-R钠电流相似。这两个变构体在稳态失活和激活方面略微不同,hNbR1和hNbR1-2的半数失活/激活(V1/2)分别为-74.4mV,-37.8mV和-81.5mV,-43.5mV,在hNbR1-2分别负向移位-5.7mV和-7.1mV。两个变构体的TTX半数抑制值(IC50)约为8μmol。结论（1）本研究首次对NB-1细胞的TTX-R钠通道进行了克隆,并描述了该通道在哺乳动物细胞株上的功能性表达。该TTX-R钠通道（hNbR1）,由Nav1.5/SCN5A基因所编码,与hH1相比有部分序列不同,经与第3号染色体基因组序列比对,可认定为新的外显子（第6A）,说明NB-1细胞TTX-R钠通道与其他Nav1.5亚家族以不同的剪切方式表达。（2）一个hNbR1的选择性剪切体（hNbR1-2）被发现,而且其电生理特点与hNbR1略有不同。相对于hNbR1,hNbR1-2易于激活,在稳态失活和激活动力学指标上(V1/2)分别负向移位-5.7mV和-7.1mV。（3）本研究丰富了Nav1.5/SCN5A钠通道亚家族的表达范围,同时,NB-1细胞株也为研究钠通道的功能、表达以及与钠通道有关的疾病的研究提供了一个新的模型系统。
论文目录:
一、摘要
1.中文论著摘要
2.英文论著摘要
二、英文缩略语
三、论文
论文一 克隆人神经母细胞瘤细胞株河豚毒抵抗型钠通道的序列分析
1.前言
2.实验材料与方法
3.实验结果(附论文图片)
4.讨论
5.结论
6.本研究创新性的自我评价
论文二 克隆人神经母细胞瘤细胞株河豚毒抵抗型钠通道的选择性剪切
1.前言
2.实验材料与方法
3.实验结果(附论文图片)
4.讨论
5.结论
6.本研究创新性的自我评价
论文三 克隆的人神经母细胞瘤细胞株TTX-R钠通道的功能分析
1.前言
2.实验材料与方法
3.实验结果(附论文图片)
4.讨论
5.结论
6.本研究创新性的自我评价
四、参考文献
五、附录
1.综述
2.在学期间科研成绩
3.致谢
4.个人简介
发布时间: 2008-04-24
参考文献
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