水稻白叶枯病菌转录调控因子FleQxoo与鞭毛基因启动子结合作用的分析

论文摘要

由水稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo）引起的白叶枯病是水稻生产上最严重的细菌性病害之一。近年来,在对Xoo致病性分子机理的研究中发现,其极生单鞭毛不仅是一种重要的运动器官,而且是潜在的致病因子之一。本室前期对Xoo鞭毛生物合成调控机理的研究表明,其鞭毛组装与调控有关的基因位于一个大约由60个基因组成的鞭毛基因簇中,其中转录调控因子FleQxoo协同σ54因子（RpoNxoo）对鞭毛运动性及其基因表达具有调控作用。然而,有关FleQxoo对鞭毛生物合成及其基因表达的调控机理尚不清楚。本研究通过对FleQxoo原核表达和纯化、与鞭毛基因启动子结合作用、鞭毛基体蛋白基因fliExoo缺失突变以及相关表型的测定,对Xoo鞭毛生物合成的调控机理进行了分析。研究目的和意义在于阐明FleQxoo作为转录主控因子在Xoo鞭毛运动性表达中的作用机理,为进一步发展新型、有效和可持续的病害控制策略提供科学依据。1. FleQxoo与鞭毛基因启动子结合。根据KACC10331菌株全基因组序列,设计fleQxoo扩增引物,用PCR方法从Xoo野生型菌株PXO99A基因组DNA中克隆了该基因。构建了原核表达载体pET21-fleQxoo,将其转化至大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）pLysS中,用IPTG进行了诱导表达。用Ni-NTA亲和层析纯化表达蛋白,经抗组氨酸单克隆抗体检测,获得了分子量约为56 kDa的FleQxoo蛋白。对部分鞭毛基因进行了启动子分析和克隆。用不同量的FleQxoo纯化蛋白与鞭毛基因启动子孵育,通过凝胶阻滞试验测定法（EMSA）检测了它们的结合作用。FleQxoo在体外能特异地与鞭毛基因fliExoo、flgFxoo和flhFxoo启动子片段发生结合。因此,FleQxoo可能通过与鞭毛基因启动子的直接结合调控了这些基因的转录。2.鞭毛基体蛋白基因fliExoo缺失突变。通过利用标记基因GmR以及同源重组交换法,构建了鞭毛基体蛋白基因缺失突变体△fliExoo。与PXO99A相比,△fliExoo鞭毛缺失,菌体易沉降,泳动能力明显降低;尽管生长速率和胞外纤维素酶活性无显著改变,但胞外多糖产生和生物膜形成能力明显下降;对水稻的致病性和引起烟草的过敏性反应都有所减弱;基因互补可以使上述突变体表型有所恢复。因此,fliExoo突变不仅影响了鞭毛运动性,而且也影响了与毒性相关的表型。3.不同鞭毛基因缺失突变体生物膜检测。分析了不同培养条件（塑料和玻璃表面、时间、温度和培养基）对Xoo生物膜形成的影响,利用结晶紫染色法测定了不同菌株生物膜形成能力。在聚苯乙烯表面上生长、用M210培养基、在23℃温度下、静止培养24 h是Xoo生物膜形成比较适宜的测试条件;鞭毛调控或组成基因fleQxoo、fliExoo和rbfCxoo的缺失突变均影响生物膜形成。不同地区来源的菌株产生生物膜能力存在差异,而这些差异与地区来源无关;因此,Xoo生物膜形成受到鞭毛合成调控或组成基因突变的影响。总之,本研究为阐明转录调控因子FleQxoo通过结合靶启动子调控Xoo鞭毛基因的表达提供了直接证据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 水稻白叶枯病菌的研究
• 1.1.1 水稻白叶枯病研究概况
• 1.1.2 水稻白叶枯病菌的致病因子
• 1.1.3 Xoo 基因组学
• 1.2 细菌鞭毛的研究
• 1.2.1 鞭毛的形态结构
• 1.2.2 鞭毛基因表达调控
• 1.2.3 鞭毛在致病性中的作用
• 54 的协同作用'>1.3 FleQ 与σ⁵⁴的协同作用
• 1.3.1 转录调控因子FleQ
• 54'>1.3.2 选择性sigma 因子σ⁵⁴
• 1.3.3 Xoo 中的sigma 因子
• 1.4 细菌基因突变的研究方法
• 1.4.1 物理诱变
• 1.4.2 化学诱变
• 1.4.3 转座子诱变
• 1.4.4 标记置换
• 1.5 细菌生物膜研究
• 1.5.1 生物膜的定义
• 1.5.2 生物膜的形成及影响因素
• 1.5.3 生物膜研究的意义
• 1.5.4 生物膜研究的热点问题与挑战
• 1.6 研究目的与意义
• 1.7 技术路线
• 第二章 转录调控因子FleQxoo 的原核表达、纯化与检测
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 技术路线
• 2.2.3 fleQxoo 基因生物信息学分析
• 2.2.4 fleQxoo 原核表达质粒的构建
• 2.2.5 FleQxoo 蛋白表达、纯化与Western blotting 检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 fleQxoo 基因生物信息学分析
• 2.3.2 fleQxoo 克隆与表达质粒构建
• 2.3.3 FleQxoo 蛋白的表达、纯化与检测
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 FleQxoo 蛋白与鞭毛基因启动子的作用
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 受FleQxoo 调控的靶基因的分析与PCR 扩增
• 3.2.2 凝胶阻滞试验（EMSA）
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 鞭毛基因启动子分析与扩增
• 3.3.2 FleQxoo 与鞭毛基因启动子的作用
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 鞭毛基体基因fliExoo 的突变体分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 供试质粒、菌株及其培养条件
• 4.2.2 主要试剂与仪器
• 4.2.3 fliExoo 基因缺失突变体构建
• 4.2.4 细菌生长速率的测定
• 4.2.5 细菌运动性测试和鞭毛的电镜观察
• 4.2.6 胞外酶活性和多糖产生的检测
• 4.2.7 生物膜形成的测定
• 4.2.8 致病性和致敏性反应测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 fliExoo 基因突变体载体构建
• 4.3.2 fliExoo 基因突变体的获得
• 4.3.3 突变体的生长性状
• 4.3.4 突变体△fliExoo 鞭毛依赖的运动性
• 4.3.5 突变体胞外酶和胞外多糖的产生
• 4.3.6 突变体生物膜形成能力
• 4.3.7 突变体的致病性和致敏性反应
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 水稻白叶枯病菌不同鞭毛基因缺失突变体生物膜检测
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 供试菌株
• 5.2.2 主要试剂、用品与仪器
• 5.2.3 生物膜形成测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 1.5 ml 离心管表面生物膜的形成
• 5.3.2 玻璃试管表面生物膜的形成
• 5.3.3 96 孔板上生物膜的形成
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历