论文摘要
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是常见的老年神经系统退行性疾病,以中脑黑质致密带多巴胺（Dopamine, DA）能神经元变性、丢失及支配纹状体神经的DA水平的下降为主要特征。其致病因素及潜在发病机制还不明确,内源性和外源性神经毒素的损害部分说明这一发病过程。多项证据表明,环境中的杀虫剂、金属、碳氢化合物等被疑为参入PD发病的起始阶段。百草枯（1,1,-dimethyl-4,4,-bypiridinium, Parquat, PQ）是一种广泛使用的非选择性的除草剂,它与已知神经毒物1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP）的活性代谢产物1-甲基-4-苯基-吡啶（1-methyl-4-pheny1-pyridium, MPP+）的化学结构极其相似,这种结构的相似性预示了它可能是PD的病原学潜在因素之一。大量流行病学研究显示长期接触PQ明显增加了PD的发病危险。研究发现PQ选择性的破坏实验动物的黑质纹状体DA能神经元。人参皂甙是来源于人参根部的药理活性成分。研究发现:通过提高胆碱能神经活力,人参皂甙Rg1和Rb1均可以逆转东莨菪碱诱导的健忘症,发挥神经营养和神经保护作用。其中人参皂甙Rg1还具有提高免疫力,延缓衰老等功效,其神经保护作用日益受到人们的关注。PC12细胞来源于大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞,具有与DA能神经元的合成物、转运系统的类似特征。而且,PC12细胞合成的递质、表达的受体接近中脑DA能神经元,是DA能神经元体外研究理想模型。然而,人参皂甙Rg1对PQ诱导的DA能神经元的损伤是否具有保护作用,目前尚未见报道。在我们的实验中,我们利用PQ诱导的PC12细胞的损伤作为PD的体外模型来研究人参皂甙Rg1可能的神经保护作用及相关机制。实验一目的:筛选出PQ诱导PC12细胞损伤的有效浓度、时间及人参皂甙Rg1对该浓度PQ损伤PC12细胞的有效保护浓度。方法:PQ损伤作用设空白对照组及100、200、400、600、800、1000μmol/L六个PQ浓度组,各浓度设12、24、36、48 h四个干预时间。人参皂甙Rg1保护作用设空白对照组、PQ组（终浓度800μmol/L）、预处理组:加PQ（终浓度800μmol/L）前分别加入浓度为5、10、20μmol/L的人参皂甙Rg1预孵育24 h。采用MTT比色法和乳酸脱氢酶（LDH）释放量测定法对各浓度进行筛选。结果:经MTT比色法检测,PQ对PC12细胞具有损伤作用,其诱导的细胞活力的降低具有剂量和时间依赖性。与空白对照组相比,800μmol/L PQ处理24 h后细胞活力为44.8±6.9%（P<0.05）。而经不同浓度的人参皂甙Rg1预处理后,我们发现5、10、20μmol/L人参皂甙Rg1预处理组与PQ组（49.5±4.2%）相比,可减少细胞损伤,细胞活力分别上升为55.7±2.8%、71.2±3.8%、84.4±3.2%（P<0.05）。空白对照组LDH（单位为:U/mg prot）的释放量为89.5±3.1,PQ组LDH释放量明显增高为180.9±3.8（与空白对照组相比P<0.05）,人参皂甙Rg1（5、10、20μmol/L）保护组抑制了PQ所引起的LDH释放量的升高（分别为160.8±3.8、145.8±4.4、118.3±4.0,与PQ组相比P<0.05）。结论:PQ对PC12细胞具有损伤作用,且这种损伤具有剂量和时间依赖性;人参皂甙Rg1对PQ所引起的PC12细胞损伤具有保护作用。实验二目的:探讨人参皂甙Rg1对PQ诱导PC12细胞凋亡的影响。方法:MTT比色试验检测细胞活性;FCM检测细胞凋亡比例;Hoechst 33258染色观察细胞核形态的改变。结果:MTT法检测显示,5、10、20μmol/L人参皂甙Rg1可抑制800μmol/L PQ作用24 h所诱导的PC12细胞活性的降低,与PQ组（46.4±3.6%）相比,人参皂甙Rg1预处理后细胞活力分别上升为53.6±3.3%、73.2±3.1%、82.2±2.6%（P<0.05）;FCM结果显示,PQ处理后,凋亡细胞的比例（48.9%）与空白对照组（12.8%）相比是增加的,而经5、10、20μmol/L人参皂甙Rg1预处理后,凋亡细胞比例分别降至39.8%,20.1%,12.3%;正常细胞核经Hoechst 33258染色后显示为较大的圆形,形态规则,染色均匀弥散。经PQ处理24 h后,多数细胞显示胞核凝集,且可见DNA荧光碎片。与PQ组相比,5、10、20μmol/L人参皂甙Rg1预处理可抑制PQ诱导的细胞损伤,显著减少胞核凝集。结论:人参皂甙Rg1可抑制PQ诱导的PC12细胞调亡。实验三目的:探讨人参皂甙Rg1对PQ诱导PC12细胞损伤的抗氧化作用机制。方法:比色法进行谷胱甘肽还原酶（GSH）、超（过）氧化物歧化酶（SOD）的活性测定。结果:PQ诱导的PC12细胞,SOD、GSH（单位均为:U/mg prot）活性较空白对照组有显著的下降（SOD的活性从130.51±5.99下降到53.12±2.67,GSH的活性从107.87±4.84下降到49.50±2.54,与空白对照组相比P<0.05）。使用5、10、20μmol/L人参皂甙Rg1预处理后,SOD、GSH活性同PQ组相比有显著的升高（SOD的活性分别为80.58±3.36、105.08±4.92、118.35±3.69;GSH的活性分别为61.53±3.90、72.90±4.32、87.39±4.54,与PQ组相比P<0.05）。结论:人参皂甙Rg1可明显抑制PQ诱导的PC12细胞SOD、GSH的活性的下降,从而表现较强的抗氧化活性。实验四目的:探讨人参皂甙Rg1对PQ诱导PC12细胞调亡作用机制。Rh123染色检测细胞线粒体膜电位（MMP）;Caspase-3活性检测;免疫细胞化学染色测Cyt C、Bcl-2表达;Western blotting方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达。结果:Rh123染色表明空白对照组细胞线粒体显示明亮绿色,荧光强度较强,表现较高的膜电位水平。PQ作用24 h后,Rh123染色荧光强度明显减弱,表明细胞MMP显著下降。分别加入5、10、20μmol/L人参皂甙Rg1后,与PQ组相比荧光强度增强,MMP显著提高;PQ组Caspase-3（单位为:pmol.min-1.mg-1）活性显著增强（与空白对照组相比P<0.001）,与PQ组（1600.6±55.7）相比,经人参皂甙Rg1预处理后,Caspase-3活性分别降至1219.7±28.7、1083.8±82.7、925.0±29.1（P<0.001）;免疫细胞化学染色显示正常组细胞形态良好,Cyt C、Bcl-2的免疫细胞化学染色呈淡棕黄色,均匀分布于胞质及突起内。PQ处理后部分细胞变圆,皱缩,Cyt C在细胞内表达增强,染色呈深棕黄色。PC12细胞的Bcl-2表达应激、代偿性增强,染色细胞呈深棕黄色,阳性染色分布于胞质和突起中,着色细胞数目多。人参皂甙Rg1预处理组的Cyt C免疫细胞化学染色明显减弱,而Bcl-2得到表达增加,细胞着色进一步加深,细胞形态也有改善。PQ组细胞Cyt C表达呈阳性细胞数（50.3%±1.6%）明显增多,5、10、20μmol/L人参皂甙Rg1预处理则明显减少Cyt C表达呈阳性细胞数（44.9±3.5%、42.0±2.6%、28.0±2.1%）,较PQ诱导组下降明显（P<0.05）; Western blotting检测Bcl-2、Bax蛋白表达,结果表明PQ处理后胞浆内Bcl-2、Bax表达增加。人参皂甙Rg1预处理后Bcl-2表达进一步增加,而Bax的表达减少,同时,Bax/Bcl-2的比率显著降低。结论:人参皂甙Rg1对PQ诱导的PC12细胞损伤具有保护作用;机制可能与其抑制PQ引起的细胞MMP下降,Caspase-3激活,调节凋亡相关蛋白Cyt C及Bcl-2、Bax在胞浆中表达有关。