乳腺珠蛋白和乳腺生长抑制因子的克隆表达及血清学研究

论文摘要

目的乳腺珠蛋白（mammaglobin,又名人乳腺珠蛋白,humanmammaglobin,hMAM）是近年来发现的一个与乳腺上皮生长有关的组织特异性蛋白,而乳腺生长抑制因子（mammastatin）是十余年前发现的一个乳腺组织特异性的生长抑制性蛋白。两种蛋白已被证实可以在血清中被检测。目前有关这两种乳腺组织特异蛋白的血清ELISA研究报道不多,其对乳腺癌的潜在诊断意义还不十分清楚。本课题的目的是通过克隆表达、抗体制备而建立两种指标的血清ELISA检测方法,并对乳腺癌患者和健康查体正常对照的血清样品进行检测,初步探讨mammaglobin和mammastatin的血清表达规律,以及对乳腺癌的诊断意义。方法我们用BioSun生物软件对mammaglobin和mammastatin氨基酸序列进行分析,确定表位序列,用PCR合成法获得mammaglobin全长基因和mammastatin表位基因,构建表达载体,转化于大肠杆菌HB101,获得重组抗原后,应用杂交瘤技术制备抗mammaglobin的单克隆抗体;mammastatin重组抗原免疫大耳白兔,获得抗血清,分别建立双抗体夹心ELISA检测方法,并对乳腺癌患者和健康查体正常对照血清样品进行检测。结果1、用PCR合成法获得乳腺珠蛋白全长基因,成功构建了两个连接不同质粒的乳腺珠蛋白原核表达载体pBVIL1/Mammaglobin和pGEX-4T-2/ Mammaglobin,并获得高效表达。pGEX-4T-2/Mammaglobin免疫小鼠后,获得了两株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别为1E12、4B11。用4B11株包被酶联板,用1E12株标记生物素,建立了稳定的双抗体夹心酶联吸附（ELISA）血清检测技术,对127例乳腺癌和133例正常对照血清进行检测,结果显示,乳腺珠蛋白mammaglobin血清表达水平在乳腺癌组（平均OD值:0.645±0.223）显著高于正常对照组（平均OD值:0.255±0.109）,P=0.0001,差异有统计学意义。对127例乳腺癌亚组分析结果显示,乳腺癌患者血清mammaglobin蛋白表达水平与病人年龄、肿瘤大小、临床分期、腋窝淋巴结转移及ER状态之间未见统计学意义的差异（P＞0.05）。2、用PCR合成法获得乳腺生长抑制因子表位基因,成功构建了两个连接不同质粒的表达载体pBVIL1—Mammastatin（12a）和pBVIL6—Mammastatin（4a）,并获得高效表达。用pBVIL1—Mammastatin（12a）及pBVIL6—Mammastatin（4a）重组抗原分别免疫大耳白兔,获得抗血清,前者包被酶联板,后者标记辣根过氧化物酶,建立了稳定的双抗体夹心ELISA检测方法。对95例乳腺癌和95例正常对照血清检测结果显示,mammastatin蛋白在乳腺癌患者血清中存在低水平表达（平均OD值0.135）,而在健康查体妇女血清中表达水平相对较高（平均OD值0.261）,二者差异显著（P＜0.01）;95例乳腺癌患者亚组分析结果显示,血清mammastatin蛋白表达水平与病人年龄、肿瘤大小、临床分期、腋窝淋巴结转移及ER状态之间未见统计学意义的差异（P＞0.05）。结论本文证实了可以通过简便无创的ELISA方法检测血清mammaglobin和mammastatin蛋白,并发现两种因子在乳腺癌患者和正常对照血清中的表达存在显著差异,但与预后等因素无关。初步结果提示这两种指标可能对乳腺癌的早期鉴别诊断有意义。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 乳腺珠蛋白mammaglobin全长基因的克隆表达及血清学研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 乳腺生长抑制因子mammastatin表位抗原的克隆表达及血清学研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文小结
• 文献综述
• 附1 博士期间发表的论文
• 附2 博士期间发表的论文
• 附3 博士期间撰写的文章
• 个人简历
• 致谢