欧李茎尖超低温保存及遗传变异分析

论文摘要

本研究的目的是建立起欧李(Prunus humilis Bunge)超低温保存体系,并对欧李超低温保存后的遗传变异情况进行检测。以玻璃化法及包埋玻璃化法两种不同超低温保存方法对欧李茎尖进行超低温保存,并初步建立起欧李茎尖的超低温保存体系。建立起欧李茎尖单芽系,并以此为材料进行欧李超低温保存后遗传变异研究。结果表明:(1)使用玻璃化法进行欧李茎尖超低温保存的欧李茎尖的再生率高于使用包埋玻璃化法进行的欧李茎尖的再生率,其再生率高达83.9 %。(2)较为适合的欧李超低温保存体系(玻璃化法超低温保存):2.0～3.0 cm的带芽茎段在含有0.5 mg/L BA和2 M的甘油的B5培养基上室温(25℃)下预培养3 d ,切取1.5～2.0 mm的茎尖在装载液中处理10～20 min,0℃下玻璃化液(PVS2)处理60 min,投入到液氮保存至少24 h后,40℃水浴化冻1 min,在含有1.2 mol/L蔗糖的B5液中洗涤40 min(每10 min换一次洗涤液),然后接种于附加0.5 mg/L BA的B5培养基上,暗培养3 d后转移到正常光下,再生率达83.9 %,再生植株生长和分化正常。(3)经AFLP分析表明在超低温保存后欧李的基因组有两个位点发生了变异,约占所有检测位点的6.2 %。(4)经MSAP分析表明在超低温保存后欧李的基因组甲基化状态发生了变化:第一次超低温保存后发生DNA甲基化状态变化的数量基本上等同于第二次超低温保存后发生变化的数量。1/3的甲基化状态发生变化的位点的甲基化模式似乎存在着累加的效应,另外,约有1/3的甲基化状态发生变化的位点的甲基化模式可以通过无性繁殖的方式传给下一代。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 欧李简介
• 1.2 欧李的研究进展
• 1.3 超低温保存的研究进展
• 1.3.1 超低温保存的理论
• 1.3.2 超低温保存的方法
• 1.3.3 超低温保存的材料的类型
• 1.3.4 影响超低温保存效果的主要因素
• 1.3.5 超低温保存中超微结构的变化
• 1.3.6 超低温保存后材料遗传变异的研究
• 1.4 植物种质资源遗传稳定性研究的方法
• 1.4.1 形态标记
• 1.4.2 细胞标记
• 1.4.3 生化标记
• 1.4.4 DNA 分子标记
• 1.5 甲基化在植物生长发育中的生物学意义
• 1.5.1 在基因组的防御中起作用
• 1.5.2 植物正常生长发育所必需
• 1.5.3 与植物的春化作用及开花有关
• 1.5.4 可调节植物内源基因的表达
• 1.5.5 可引起转基因沉默
• 1.6 研究目的、内容和意义
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究内容
• 1.6.3 研究意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 仪器设备
• 2.3 主要试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 欧李茎段的组织培养
• 2.4.2 单芽系的建立
• 2.4.3 欧李茎尖玻璃化法超低温保存
• 2.4.4 第二次超低温保存程序
• 2.4.5 再生率的统计及表型观测
• 2.4.6 欧李茎尖包埋玻璃化法超低温保存
• 2.4.7 超低温保存单芽系的建立及后续实验提取 DNA 叶片的来源
• 2.4.8 遗传变异检测方法
• 3 结果与分析
• 3.1 欧李超低温保存体系的建立
• 3.1.1 欧李茎尖玻璃化法超低温保存
• 3.1.2 欧李茎尖包埋玻璃化法超低温保存
• 3.1.3 欧李茎尖玻璃化法超低温保存与包埋玻璃化法超低温保存对再生率的影响
• 3.2 超低温保存单芽系的建立
• 3.3 欧李单芽系超低温保存前后AFLP分析
• 3.4 欧李单芽系超低温保存前后 MSAP 分析
• 4 讨论
• 4.1 超低温保存在种质资源保存中的地位
• 4.2 欧李茎尖作为超低温保存材料的原因
• 4.3 欧李茎段组织培养过程中玻璃化现象
• 4.4 欧李茎尖超低温保存
• 4.5 欧李茎尖超低温保存的遗传分析
• 4.5.1 欧李茎尖超低温保存的基因组序列分析
• 4.5.2 欧李茎尖超低温保存的基因组甲基化分析
• 4.6 后续实验
• 5 结论
• 5.1 本研究初步的建立了欧李超低温保存体系
• 5.2 筛选出合适的欧李茎尖超低温保存方法
• 5.3 欧李的超低温保存过程引起了欧李基因组序列和甲基化状态的变化
• 图版及图版说明
• 参考文献
• 致谢