费氏中华根瘤菌HN01 smrA所在基因簇的启动子结构及调控初步研究

论文摘要

在生物固氮体系中，根瘤菌的结瘤能力是决定共生固氮效率的一个重要因素。费氏中华根瘤菌HN01由于生长速度快，胞外多糖少而被用作生物固氮研究的模式菌株。本实验室利用转座子突变法从费氏中华根瘤菌HN01基因组中筛选到一个与硫代谢相关并影响菌株结瘤能力和结瘤时间的基因smrA。通过序列分析发现在smrA的上游有4个转录方向相同的基因即ORFa、ORFb、ORFc、ORFd和一个共同的启动子序列，而在该基因的下游是另外一个具有相同转录方向的基因ORFe。在ORFd和ORFe之间也存在可能的启动子序列。本工作的目的一是验证smrA基因是否与其它基因共同组成一个操纵子；二是研究硫对该操纵子表达调控的影响。首先对两个可能的启动子区域P1和P2的启动子活性进行了研究。根据测序的结果设计引物，通过PCR扩增得到了ORFa的ATG上游297bp长的P1片段和ORFe上游321bp长的P2片段。通过融合PCR将这两个片段分别融合到无启动子的gus基因上游。将这两个融合片段插入质粒载体pTR102，通过三亲本结合法导入费氏中华根瘤菌HN01中。对这两个重组根瘤菌进行GUS活性检测以验证导入片段的启动子活性，结果表明P1和P2片段都具有启动子功能，从而说明了smrA基因所在操纵子包括了ORFa、ORFb、ORFc和ORFd，但不包括ORFe。通过研究硫源对P1片段启动子活性的影响发现，在添加有碳源和氮源的MM培养基中，启动子活性最高，而在添加了碳、氮、硫源（硫源分别为Na2SO4、Na2SO3、Na2S2O3和Met）的MM培养基中，启动子活性均有明显降低，推测硫对P1片段的启动子活性有抑制作用。对P1片段进行5’端缺失，得到了四条不同长度的片段，分别包括ORFa上游序列215bp、143bp、102bp、55bp。通过测定P1片段及其5′端缺失片段在含有不同浓度的不同硫源培养基中的活性发现，在100μM硫浓度条件下，甲硫氨酸的抑制作用要显著强于硫酸盐、亚硫酸盐和硫代硫酸盐。ORFa上游143bp序列已经能完全行使启动子功能，而ORFa上游102bp和55bp序列则无启动子活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 概述
• 1.1.1 生物固氮概述
• 1.1.2 豆科植物中固氮共生体系研究
• 1.1.3 固氮共生体系中与硫代谢有关的结瘤基因
• 1.1.4 豆科植物固氮研究的发展方向
• 1.1.5 启动子的研究概况
• 1.2 本课题研究的背景、意义和内容
• 1.2.1 本课题研究的背景、意义
• 1.2.2 本课题研究内容和目标
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 培养基及生长条件
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 生长条件
• 2.2.3 菌种保存
• 2.3 抗菌素
• 2.4 主要溶液、缓冲液和试剂
• 2.5 核酸的提取
• 2.5.1 碱变性法提取质粒DNA
• 2.5.2 大量制备质粒DNA
• 2.5.3 试剂盒快速小量提取质粒DNA
• 2.5.4 根瘤菌总DNA的提取
• 2.6 PCR扩增
• 2.6.1 引物设计
• 2.6.2 ORFa和ORFe 5’侧翼DNA片段P1、P2以及gus基因的扩增
• 2.6.3 DNA片段P1、P2分别与gus基因融合
• 2.7 DNA片段的酶切、电泳和回收纯化
• 2.7.1 酶切克隆载体pGEM3zf（+）
• 2.7.2 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.7.3 DNA片段的回收纯化
• 2.8 目的片段连入PGEM3ZF（+）载体
• 2.9 大肠杆菌感受态的制备和转化
• 2.9.1 大肠杆菌感受态的制备
• 2.9.2 质粒DNA转化大肠杆菌
• 2.10 重组质粒的细菌菌落的鉴定
• 2.10.1 蓝白斑筛选----a互补现象的检测
• 2.10.2 质粒酶切鉴定
• 2.10.3 重组质粒的PCR检测
• 2.11 克隆片段的测序分析
• 2.12 启动子缺失片段的PCR扩增
• 2.13 表达质粒的构建
• 2.13.1 分别双酶切载体pTR102和重组克隆质粒酶切体系如下:
• 2.13.2 表达载体的构建
• 2.13.3 表达载体的转化和质粒提取
• 2.13.4 酶切鉴定表达载体
• 2.14 表达质粒转化根瘤菌HN01
• 2.15 GUS活性的检测
• 2.15.1 片段P1、P2启动子活性的定性检测
• 2.15.2 GUS（β-Glucuronidase）活性的定量测定
• 2.15.3 200mM硫浓度下不同硫源对P1片段启动子活性的影响
• 2.15.4 DNA片段P1及其的5’端缺失片段的启动子活性检测
• 2.15.5 DNA片段P1及其的5’端缺失片段在含有不同浓度的不同硫源培养基中的活性检测
• 第三章 启动子的鉴定与结构分析
• 3.1 引言
• 3.2 ORFA和ORFE 5’侧翼序列P1、P2的扩增并与GUS基因的融合
• 3.3 P1片段5’端缺失片段的克隆并与GUS基因的融合
• 3.4 表达载体的构建
• 3.5 表达载体的转化
• 3.6 ORFA和ORFE 5’侧翼序列启动子活性的定性检测
• 3.7 DNA片段P1及其5’端缺失片段的GUS活性检测
• 3.8 讨论
• 第四章 启动子的诱导表达
• 4.1 引言
• 4.2 200MM硫浓度下不同硫源对P1片段启动子活性的影响
• 4.3 DNA片段P1及其5’端缺失片段在含有不同浓度的不同硫源培养基中的启动子活性
• 4.4 讨论
• 第五章 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文