miR-26b和miR-125b调控神经胶质瘤细胞增殖和凋亡的分子机制研究

论文摘要

MicroRNAs（miRNAs）是一类长约22个核苷酸、进化上高度保守的内源性非编码单链RNA,它通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶mRNA降解或者抑制其翻译,从而调节基因的转录后表达水平。miRNAs表达水平的异常变化与人类肿瘤密切相关,许多miRNAs被证实在肿瘤发生、发展中起到了非常重要的作用。胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤。miRNAs的异常表达与胶质瘤的发生密切相关。我们对胶质瘤的研究中发现miR-26b在胶质瘤中的表达降低,但miR-26b在神经胶质瘤中的具体功能及其分子机制尚不清楚,本论文进行了miR-26b在神经胶质瘤中的功能探索并寻找miR-26b发挥作用的靶基因。miR-125b在胚胎神经系统发育过程中高表达,但在出生后和成年的脑组织中维持相对较低水平的表达。目前研究发现miR-125b在恶性胶质瘤细胞中异常表达影响细胞增殖,但对miR-125b在胶质瘤细胞中的表达特性还不明确、与细胞增殖与凋亡的关系尚不清楚。本研究将探讨miR-125b在不同级别恶性胶质瘤中表达特性和对胶质瘤细胞增殖和凋亡及药物敏感性的影响,以及miR-125b影响恶性胶质瘤细胞增殖和凋亡的作用机制。近年来研究表明miRNAs表达变化与肿瘤干细胞发生密切相关,但其在胶质瘤干细胞中的作用尚不清楚。本研究通过研究miRNAs在脑肿瘤干细胞样细胞中的表达变化,同时将研究miR-125b在脑肿瘤干细胞样细胞增殖和分化中的作用。我们利用Real-time PCR的方法检测了在正常人脑组织、WHO分级不同神经胶质瘤组织和U87MG、U251和大鼠C6细胞中miR-26b和miR-125b的表达情况。结果发现,miR-26b在神经胶质瘤组织中随胶质瘤恶性程度升高表达下调,同时在3株恶性胶质瘤株中也呈低水平表达。在U251和C6细胞中分别转染miR-26b模拟物过表达miR-26b,结果显著抑制了U251和C6细胞的增殖、迁移和侵袭能力。对miR-26b的可能作用靶基因预测结果显示EphA2基因可能是miR-26b的潜在靶基因,且EphA2基因的表达特性与miR-26b相反在恶性程度越高的组织中表达水平越高,在胶质瘤组织和恶性胶质瘤细胞U251和C6细胞中呈高水平表达。荧光素酶报告基因实验表明,miR-26b能特异性的通过EphA2 3’UTR上的预测位点抑制报告基因的活性;Western blotting试验证实miR-26b过表达抑制内源EphA2基因的表达,且胶质瘤细胞体外血管生成拟态试验表明,miR-26b能过特异性抑制EphA2的表达从而抑制胶质瘤细胞血管生成拟态的形成。在EphA2基因低表达的U87MG细胞中,miR-26b对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制不显著,说明miR-26b在胶质瘤中的调控作用于EphA2的表达水平相关。我们研究发现,miR-125b在胶质瘤组织中的表达特性随着胶质瘤恶性程度升高表达上调,且在三株恶性胶质瘤株中表达水平也相对较高。过表达miR-125b促进胶质瘤细胞的增殖,细胞S期增加。通过转染2’甲氧基修饰的miR-125b的反义寡核苷酸敲低内源性miR-125b的表达,胶质瘤细胞增殖受到抑制。Hoest33342染色、AV-FITC流式细胞分析和TUNEL试验分析表明,降低内源miR-125b的表达促进胶质瘤细胞凋亡。为研究miR-125b是否对化疗药物ACNU的作用有影响,将miR-125b与化疗药物尼莫司汀（Nitronan, ACNU）联合应用,结果表明miR-125b高表达抑制U87MG细胞对ACNU的敏感性,当封闭内源MiR-125b表达时U87MG对ACNU的敏感性显著增强。表明,miR-125b在胶质瘤中可能起到减低其对化疗药物ACNU敏感性的作用。应用稳定表达miR-125b和miR-125b缺失的U87（p53野生型）和U251（p53突变）细胞及对照细胞,研究miR-125b影响胶质瘤细胞凋亡是否通过p53依赖途径。Western blotting检测p53、BCL-2、BAX、Caspase-9和Caspase-3基因的表达变化。结果表明,过表达miR-125b抑制p53基因的表达,而下调内源miR-125b的表达时p53及caspase-3明显被激活。但分别在p53野生型U87MG细胞、p53突变型U251细胞以及p53敲除的U87MG细胞中下调内源miR-125b的表达,细胞凋亡仍然发生。这说明,miR-125b调控胶质瘤细胞凋亡不是通过p53依赖途径实现的。进一步研究发现p38 MAPK蛋白在内源miR-125b下调的神经胶质瘤细胞中被特异性激活。将p38MAPK抑制剂SB203580加到细胞培养液中,由miR-125b缺失表达诱导的细胞凋亡现象仍然发生。说明,miR-125b通过p53非依赖途径和p38MAPK非依赖通路调控神经胶质瘤细胞的凋亡。从恶性胶质瘤细胞株U87MG中分离脑肿瘤干细胞样细胞,并应用miRNA表达谱芯片检测神经胶质瘤干细胞样细胞和U87MG细胞中miRNA的表达谱; MicroRNA基因芯片分析表明,在脑肿瘤干细胞样细胞中上调超过5倍的miRNA有30个,其中miR-125b表达上调7.56倍。在脑肿瘤干细胞样细胞中下调miR-125b,细胞分化出现抑制,说明miR-125b在调控肿瘤干细胞分化中起重要作用。通过本研究发现,miR-26b在神经胶质瘤细胞中可能起到抑癌基因的作用,EphA2基因是miR-26b在胶质瘤细胞中的直接靶基因。miR-125b在胶质瘤细胞中具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、拮抗化疗药物ACNU的作用。miR-125b通过非特异性的抑制p53基因和p38MAPK的表达调控胶质瘤细胞凋亡。同时发现,miRNA表达谱在脑肿瘤干细胞样细胞中和胶质瘤细胞中存在较大差异,这部分差异表达的miRNAs可能参与调控脑肿瘤干细胞的生长和分化,其中miR-125b过表达抑制肿瘤干细胞分化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 图目录
• 表目录
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 非编码小RNA 的分类
• 1.2.1 转移RNA
• 1.2.2 核仁RNA
• 1.2.3 核RNA
• 1.2.4 噬菌体和病毒RNA
• 1.2.5 小干扰RNA
• 1.2.6 microRNA
• 1.3 microRNA 的发现及生成机制
• 1.3.1 microRNA 的发现历程
• 1.3.2 microRNA 的生物形成机制
• 1.4 microRNA 的调控方式
• 1.4.1 microRNA 调控方式与siRNA 的异同
• 1.5 microRNA 与肿瘤
• 1.5.1 microRNA 通过负调控致癌基因或抑癌基因调控肿瘤生物特性
• 1.5.2 microRNA 与肿瘤细胞增殖和凋亡
• 1.5.3 microRNA 与肿瘤的治疗
• 1.5.4 miRNA 与神经胶质瘤
• 1.6 MicroRNA 与肿瘤干细胞
• 1.6.1 肿瘤干细胞及其产生机制
• 1.6.2 miRNA 与肿瘤干细胞调控的关系
• 1.7 miR-26b 和miR-125b的研究现状
• 1.8 本研究的目的及意义
• 2 miR-26b 在神经胶质瘤中的表达特性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.2 酶及主要试剂
• 2.1.1.3 主要仪器设备
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 神经胶质瘤病理分级结果及WHO 分级
• 2.2.2 RNA 质量检测
• 2.2.3 Real-time PCR 分析miR-26b 在不同恶性程度胶质瘤样本中的表达情况
• 2.3 讨论
• 2.4 本章结论
• 3 MicoRNA-26b 调控胶质瘤细胞增殖、侵袭和血管生成拟态的分子机制
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 miR-26b 转染效率检测
• 3.2.2 miR-26b 对胶质瘤细胞增殖的影响
• 3.2.3 miR-26b 对胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响
• 3.2.4 miR-26b 直接调控的靶基因分析
• 3.3 讨论
• 3.4 本章结论
• 4 microRNA-125b在神经胶质瘤中的表达特性及对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 miR-125b在胶质瘤组织和细胞中的表达情况
• 4.2.2 在神经胶质瘤细胞中过表达miR-125b促进细胞增殖
• 4.2.3 miR-125b对胶质瘤细胞周期的影响
• 4.2.4 miR-125b对胶质瘤细胞凋亡的影响
• 4.2.5 miR-125b对胶质瘤细胞集落形成的影响
• 4.2.6 miR-125b对神经胶质瘤细胞化疗药物ACNU 敏感性影响
• 4.2.7 miR-125b缺失表达增强胶质瘤细胞ACNU 诱导的细胞凋亡
• 4.3 讨论
• 4.4 本章结论
• 5 micoRNA-125b调控神经胶质瘤细胞增殖和凋亡的分子机制
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 miR-125b慢病毒表达载体的稳定转染
• 5.2.2 Real-time PCR 检测稳定转染miR-125b表达载体和miR-125b干扰载体的U87MG细胞中miR-125b的表达情况
• 5.2.3 p53 干扰载体效率检测
• 5.2.4 抑制miR-125b的表达引起细胞凋亡相关基因的表达变化
• 5.2.5 p53 在miR-125b缺失的细胞中特异性激活
• 5.2.6 miR-125b缺失诱导的细胞凋亡不依赖于p53 的激活
• 5.2.7 miR-125b调控p38MAPK 表达
• 5.2.8 p38MAPK 和p53 表达同时抑制时由miR-125b缺失引起的细胞凋亡
• 5.3 讨论
• 5.4 本章结论
• 6 miRNA 在胶质瘤干细胞中的差异表达及miR-125b在调控胶质瘤干细胞增殖和分化中的作用
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 肿瘤干细胞的形成和鉴定
• 6.2.2 microRNAs 在U87MG 细胞和脑瘤干细胞中的差异性表达
• 6.2.3 miR-125b和let-7a/c 在U87MG 细胞和脑瘤干细胞中的表达检测
• 6.2.4 miR-125b抑制脑瘤干细胞样细胞的增殖
• 6.2.5 miR-125b调控脑瘤干细胞样细胞分化
• 6.3 讨论
• 6.4 本章结论
• 7 结论和创新点
• 8 参考文献
• 9 发表文章
• 10 致谢