高迁移率蛋白A族2在非小细胞肺癌中作用的研究

论文摘要

第一部分高迁移率蛋白A族2在非小细胞肺癌中的表达及其与细胞增殖关系目的探讨高迁移率蛋白A族2（High Mobility Goup A2 protein，HMGA2）在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理因素和细胞增殖的关系。方法应用免疫组化法检测38例非小细胞肺癌（23例鳞癌，15例腺癌）及癌旁的正常肺组织标本中HMGA2和Ki-67的表达，并将HMGA2的表达与增殖指标Ki-67及其他临床病理因素进行相关性分析。结果HMGA2和Ki-67在癌旁的正常肺组织中均不表达，而在肺癌组织中的表达阳性率分别为39．47％、44．74％，二者在肺癌组和癌旁的正常肺组织组之间的表达有显著性差异（P＜0．05）。HMGA2的表达在伴淋巴结转移的肺癌组织明显高于不伴有淋巴结转移癌者（P＜0．05），而与其他临床病理参数包括肿瘤的分化程度、肿瘤大小和TNM分期以及细胞增殖指标Ki-67之间没有相关性。结论本研究显示HMGA2在非小细胞肺癌组织中异常表达，与肺癌的发生和进展有关。第二部分重组质粒pGCsi3．0U6／HMGA2 shRNA的构建及其在人肺鳞癌细胞SK-MES-1中的表达目的构建HMGA2基因短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）的表达质粒，并检测其在人肺鳞癌细胞SK-MES-1中的表达。方法设计并合成有短发夹结构的HMGA2shRNA对应的模板序列，退火并与pGCsi3．0U6／Neo／GFP／RNAi载体重组，经测序分析证实重组载体构建成功。体外培养SK-MES-1细胞，分为空白对照组、特异性干扰组和阴性对照组，应用Lipofectamine2000分别转染各组质粒。转染48小时后，在荧光显微镜下观察转染细胞表达的绿色荧光蛋白。应用RT-PCR、Western blot检测三组细胞HMGA2的mRNA和蛋白的表达情况。结果经测序分析证实重组的pGCsi3．0U6／HMGA2 shRNA质粒构建成功。荧光显微镜下观察发现有大量的绿色荧光蛋白，即质粒成功转染入SK-MES-1细胞中。与空白对照组比较，特异干扰组和阴性对照组中HMGA2mRNA的表达分别为空白对照组中HMGA2mRNA表达的（48．13±0．15）％和（97．33±0．08）％。与空白对照组比较，特异干扰组和阴性对照组中HMGA2蛋白的表达分别为空白对照组中HMGA2蛋白表达的（42．31±0．05）％和（96．07±0．09）％。结论成功构建表达HMGA2shRNA的干扰质粒，能够明显下调SK-MES-1细胞中HMGA2的表达。第三部分瞬时转染短发夹RNA沉默HMGA2基因对体外人肺鳞癌细胞SK-MES-1的细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响目的研究瞬时转染短发夹RNA沉默HMGA2基因对肺鳞癌细胞SK-MES-1的细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，并探讨可能的机制。方法体外培养SK-MES-1细胞，分为空白对照组、特异性干扰组和阴性对照组，分别转染相应的质粒。使用MTT法检测三组细胞的增殖，流式分析法检测细胞周期和细胞凋亡。采用Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力，Transwell侵袭实验则检测细胞的侵袭能力。结果与空白对照组和阴性对照组比较，特异性干扰组中瞬时沉默HMGA2基因的表达导致SK-MES-1细胞增殖活性显著下降（P＜0．01），并且G1期细胞的百分比也显著升高（P＜0．05）。三组细胞中均没有检测到凋亡的峰值（P＞0．05）。Transwell迁移实验结果显示，特异干扰组细胞穿膜数为（62．3±6．8），显著低于空白对照组（151．3±6．5）和阴性对照组（139．7±9．5）（P＜0．01）。Transwell侵袭实验结果显示，特异干扰组细胞穿膜数为（37．7±3．2），显著低于空白对照组（84．0±3．6）和阴性对照组（72．3±7．7）（P＜0．01）。结论瞬时转染短发夹RNA沉默HMGA2基因可以抑制SK-MES-1细胞的增殖、迁移和侵袭，但是对细胞凋亡没有作用。HMGA2可能参与非小细胞肺癌的发生、发展，可能作为非小细胞肺癌治疗的理想靶点之一。第四部分稳定转染短发夹RNA沉默HMGA2基因抑制人肺鳞癌裸鼠移植瘤的生长目的研究通过稳定转染短发夹的RNA沉默HMGA2基因对人肺鳞癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法体外培养SK-MES-1细胞，分为特异性干扰组和阴性对照组，分别转染pGCsi3．0U6／HMGA2 shRNA质粒和pGCsi3．0U6／Neo／GFP／NON RNAi质粒。瞬时转染后，经过G418筛选形成稳定筛选的细胞，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，用Western blot检测HMGA2蛋白的表达水平。将两组稳定筛选的细胞制作成细胞悬液，注射到裸鼠皮下，观察移植瘤的生长。第5周时处死裸鼠，取下移植瘤瘤块、称重，常规HE染色后显微镜下观察。比较两组细胞的移植瘤成瘤率、移植瘤体积和质量。结果经过G418稳定筛选的特异性干扰组和阴性对照组细胞，在荧光显微镜下均表达绿色荧光蛋白。特异性干扰组的HMGA2蛋白表达水平是阴性对照组的（41±0．20）％，与阴性对照组相比较，特异性干扰组的HMGA2蛋白表达水平显著下降，有统计学差异（P＜0．05）。特异性干扰组5只裸鼠中有3只发现有肿瘤生长，成瘤率为60％，而阴性对照组则是5只裸鼠中有4只裸鼠成瘤，成瘤率为80％，两组细胞在成瘤率上没有显著性差异（P＞0．05）。接种5周后，特异性干扰组和阴性对照组的移植瘤的体积分别为（0．147±0．058）cm3、（0．324±0．069）cm3，质量依次为（0．109±0．027）mg和（0．238±0．045）mg。与阴性对照组相比较，特异性干扰组移植瘤体积和质量均显著降低，有统计学差异（P＜0．05）。特异性干扰组和阴性对照组移植瘤组织切片HE染色，光镜下观察发现均可见到成巢的肿瘤细胞。结论干扰HMGA2表达的短发夹RNA质粒在稳定筛选的细胞中有效地下调了HMGA2蛋白的表达，并能抑制人肺鳞癌裸鼠皮下移植瘤的生长。Syk在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理因素的关系目的探讨脾酪氨酸激酶（Spleen tyrosine kinase，Syk）在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理因素和p53的关系。方法应用免疫组织化学的方法检测了39非小细胞肺癌组织（23例肺鳞癌，16例肺腺癌）和癌旁正常肺组织标本中Syk和p53蛋白的表达，并将Syk蛋白的表达与临床病理因素和p53蛋白的表达进行相关性分析。结果Syk蛋白在非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织中的表达阳性率分别46．12％（18／39）和100％，Syk蛋白在非小细胞肺癌的表达显著低于癌旁正常肺组织（P=0．000）。Syk蛋白在非小细胞肺癌中的表达与p53蛋白的表达有正相关性（P=0．025），而与淋巴结转移、分化程度、肿瘤大小和TNM分期没有相关性。结论Syk在非小细胞肺癌中异常表达，可能参与到肿瘤的发生、发展过程中。

论文目录

• 论文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 一、HMGA2在非小细胞肺癌中作用的研究
• 研究背景
• 第一部分 高迁移率蛋白A族2在非小细胞肺癌中的表达及其与细胞增殖关系
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 重组质粒pGCsi3.0U6/HMGA2 shRNA的构建及其在人肺鳞癌细胞SK-MES-1中的表达
• 材料和方法
• 实验结果
• 参考文献
• 第三部分 瞬时转染沉默HMGA2基因对人肺鳞癌细胞SK-MES-1的细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 稳定转染短发夹RNA沉默HMGA2基因抑制人肺鳞癌裸鼠移植瘤的生长
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 二、SYK在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理因素的关系
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 HMGA蛋白及其在恶性肿瘤中作用的研究进展
• 附录 攻读博士期间撰写文章及发表情况
• 致谢