论文摘要
MicroRNAs是一类长约22个核苷酸、进化上高度保守的内源性非编码RNA,通过转录后水平调节靶基因发挥作用。许多miRNAs被认为在肿瘤发生发展中起到了非常重要的作用,其中部分miRNAs在肿瘤中的作用被看作是原癌miRNA基因（OncomiRs）。神经胶质细胞瘤是中枢神经系统中最常见的肿瘤,起源于神经前体细胞和/或分化的星形胶质细胞等。miR-9是一个在神经系统发育过程中高表达,但在出生和成年后维持相对低表达的miRNA,已有文献报道,它在两种神经胶质瘤（神经母细胞瘤和少突胶质瘤）中异常高表达,但有关miR-9在神经胶质瘤中的具体功能及其分子机制尚不清楚。本论文进行了miR-9在神经胶质瘤中的功能探索并寻找miR-9发挥作用的靶基因。我们首先利用Real-time PCR的方法检测了2例正常人脑组织、9例神经胶质瘤组织（Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级各3例）和3株神经胶质瘤细胞系（A172、T98G和U87MG）中miR-9的表达情况。结果发现,miR-9在神经胶质瘤组织和细胞中明显上调。后续研究以miR-9表达量最高的T98G细胞系为模型,通过转染2’-O-Me-miR-9敲低内源性miR-9的表达,然后再用MTT和流式细胞术分析miR-9对细胞增殖的影响。结果发现,T98G细胞中miR-9敲低后,G1期细胞百分比减少,细胞增殖加快。由于miRNAs往往通过调控其靶基因发挥作用,为了进一步阐述miR-9在神经胶质瘤中发挥功能的分子机制,我们结合生物信息学和生物学实验寻找了miR-9发挥作用的靶基因:首先对已有的miRNA靶基因预测算法（miRanda）进行了基于机器学习法的改良,荧光素酶报告基因实验表明,改良后算法能提高miRanda预测的有效性,缩减了候选靶基因的范围;随后,我们用改良后算法对miR-9的靶基因进行了筛选,筛选后结果和文献分析提示,CBX7是可能miR-9的潜在靶基因之一。随后在293ET细胞中,我们在过表达miR-9的基础上,进行了荧光素酶和EGFP两种报告基因实验。结果发现,miR-9能特异性的通过CBX7 3’UTR上的预测位点抑制报告基因的活性,证明CBX7的确是miR-9的靶基因。为了进一步验证miR-9对神经胶质瘤中内源性CBX7的调控作用,我们首先利用Western Blot和RT-PCR的方法检测了2例人正常脑组织、9例神经胶质细胞瘤组织和3种胶质瘤细胞系中CBX7的表达。结果发现,CBX7蛋白在神经胶质瘤组织和细胞系中明显下调或缺失,而其mRNA水平与正常脑组织的差异不明显。随后,在T98G细胞中敲低内源性miR-9的表达后,发现miR-9敲低能显著的上调含CBX7-3’UTR的荧光素酶报告基因的活性,并使细胞中内源性CBX7的蛋白水平明显上调,而mRNA不发生明显的变化。最后,我们在T98G细胞中过表达CBX7蛋白,通过MTT和流式细胞术分析CBX7过表达对肿瘤细胞增殖的影响。结果发现,T98G细胞中CBX7过表达后,G1期细胞减少,细胞增殖加快,与前面miR-9敲低的结果一致。综合以上研究结果,我们初步证明:在人神经胶质细胞瘤中,异常高表达的miR-9通过转录后水平抑制其靶基因CBX7的表达,导致肿瘤中CBX7的表达下调甚或缺失,并可能由此使细胞阻滞于G1期,影响胶质瘤细胞的增殖。