Mcl-1特异性shRNA联合凋亡素治疗肝细胞癌的实验研究

论文摘要

原发性肝癌是全球第5大恶性肿瘤，在肿瘤相关死亡中排在第3位。手术切除和肝移植仍是当前可能治愈肝癌的主要方法，但绝大多数患者被确诊时已是晚期，失去手术时机。此外，现有的化疗药物并不能提高肝癌患者的生存率，因此，探求新的更有效的肝癌治疗方法是当前迫切需要解决的问题。髓细胞白血病基因-1（myeloid cell leukemia-1 mcl-1）是bcl-2家族成员，其主要作用是促进细胞生存，抑制细胞凋亡。Mcl-1在肝癌组织中明显呈高表达状态，被认为与肝癌的发生密切相关。凋亡素（apoptin）是鸡贫血病毒VP3基因编码的蛋白，能选择性地诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无诱导凋亡作用。RNA干扰（RN Ain terference，RNAi）技术是一种能够有效抑制目的基因表达的基因治疗工具，已被广泛应用于目的基因功能研究和肿瘤的基因治疗中。本研究针对mcl-1mRNA设计、构建并筛选出表达小发卡状RNA（short hairpin RNA，shRNA）的重组表达质粒，观察mcl-1特异性shRNA对肝癌细胞凋亡的影响，以及与凋亡素联合对肝癌增殖和凋亡的作用，为肝癌的治疗提供新的策略。第一部分靶向mcl-1基因的shRNA真核表达质粒的构建与鉴定目的设计并构建靶向mcl-1基因并含有EGFP基因的shRNA表达质粒。方法根据shRNA的设计原则、载体pGenesil-1.1的酶切位点以及Gengank中mcl-1mRNA序列，设计并合成3对编码shRNA的寡核苷酸链，将寡核苷酸链退火形成互补双链，再克隆至载体pGenesil-1中，构建重组质粒mcl-1.1～mcl-1.3，将质粒转化DH5α菌株，提取质粒，行酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果所构建的重组质粒mcl-1.1～mcl-1.3经酶切鉴定及DNA测序证实符合设计要求，证实质粒mcl-1.1～mcl-1.3构建成功。结论成功构建了靶向人mcl-1基因shRNA表达质粒，为一步利用shRNA表达质粒进行肝细胞癌治疗研究奠定了基础。第二部分Mcl-1特异性shRNA的筛选及其对肝癌细胞凋亡的影响目的从所构建的3个shRNA质粒中筛选出对mcl-1基因抑制作用最强的质粒，并观察该质粒对肝癌细胞HepG2凋亡的影响。方法经Lipofectamine 2000介导将所构建的重组质粒mcl-1.1～mcl-1.3及阴性对照质粒HK转染HepG2。转染后48 h于荧光显微下观察并计算质粒的转染率，并分别利用RT-PCR和western blot检测细胞内mcl-1 mRNA和蛋白，确定3种质粒对mcl-1基因的抑制效率，筛选出对mcl-1基因抑制作用最强的质粒。采用Hoechst染色观察所选质粒转染HepG2细胞48 h后的凋亡形态学改变，及PI单染行流式细胞仪检测HepG2的凋亡率。结果重组质粒mcl-1.1～mcl-1.3和阴性对照质粒HK对HepG2的转染率分别为64.00％±3.77％、64.20％±2.10％、63.70％±3.34％和62.5％±2.42％，各组间转染率无明显差异（P=0.59）。质粒mel-1.1～mcl-1.3组mcl-1 mRNA的相对含量分别为0.61±0.02、0.56±0.02和0.46±0.01，mcl-1蛋白的相对含量分别为0.54±0.01、0.48±0.03、0.36±0.01，与HK（mRNA：0.95±0.00，蛋白：0.88±0.01）和空白对照组（mRNA：0.97±0.01，蛋白：0.90±0.03）相比均存在显著性差异（均P=0.00）。质粒Mcl-1.3对mcl-1mRNA和蛋白的抑制率分别为52.27±0.00％和58.98±0.01％，均高于mcl-1.1（mRNA：36.26±0.12％，蛋白：38.80±0.02％）和mcl-1.2（mRNA：41.47±0.13％，蛋白：45.70±0.02％） （均P=0.00）。转染mcl-1.3的细胞经Hoechst染色出现明显凋亡核形态学表现。经流式检测，mcl-1.3转染组HepG2的凋亡率明显高于HK组（7.74％±0.97％VS 2.81％±0.46％P=0.00）结论成功筛选出靶向mcl-1基因的shRNA真核表达质粒，其对肝癌细胞HepG2内的mcl-1基因表达具有明显抑制作用，并可直接导致肝癌细胞凋亡。利用shRNA沉默Mcl-1基因可能是肝癌基因治疗的有效途径之一。第三部分Mcl-1特异性shRNA联合凋亡素对肝癌细胞增殖和凋亡的影响目的观察mcl-1特异性shRNA与凋亡素联合作用对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法利用质粒mcl-1.3和pGensil-1.2构建靶向mcl-1基因但不含有EGFP基因的shRNA表达质粒pmcl-1，然后将质粒pmcl-1和pcDNA3.0-vp3转入肝癌细胞HepG2内，利用RT-PCR和western blot检测细胞内mcl-1和vp3的mRNA与蛋白含量及细胞色素C含量，采用MTT法测定细胞增殖情况，Annexin V-FITC／PI双染检测细胞的凋亡率。结果所构建的重组质粒pmcl-1经酶切及DNA测序证实符合设计要求，证实构建成功。经RT-PCR和western blot检测显示，pmcl-1+pcDNA3.0-vp3转染组和pcDNA3.0-vp3转染组vp3阳性，pmcl-1转染组及阴性对照组和空白对照组vp3均为阴性。pmcl-1+pcDNA3.0-vp3组的vp3 mRNA含量为0.83±0.02，蛋白含量为1.48±0.06，与pcDNA3.0-vp3组相比无明显差异（mRNA：0.78±0.37，P=0.20；蛋白：1.40±0.08，P=0.81）。质粒pmcl-1、pcDNA3.0-vp3及pmcl-1+pcDNA3.0-vp3均可明显下调细胞内mcl-lmRNA和蛋白水平，促进线粒体细胞色素C的释放。其中pmcl-1+pcDNA3.0-vp3组的mcl-1 mRNA含量为0.34±0.05，蛋白含量为0.38±0.02，与pmcl-1组（mRNA：0.46±0.03，蛋白0.44±0.03）和pcDNA3.0-vp3组（mRNA：0.43±0.01，蛋白：0.43±0.01）相比，差异均有显著性（均P＜0.05）。pmcl-1+pcDNA3.0-vp3组的细胞色素C含量为1.21±0.09，明显高于pmcl-1组（0.96±0.03，P=0.01）和pcDNA3.0-vp3组（0.98±0.02，P=0.01）。与阴性对照及空白对照相比，质粒pmcl-1、pcDNA3.0-vp3和pmcl-1+pcDNA3.0-vp3处理组的HepG2细胞在转染后1～5天的生长均明显受到抑制，其中质粒pcDNA3.0-vp3对HepG2的生长抑制作用在各时间点均强于pmcl-1（均P=0.00），pmcl-1联合pcDNA3.0-vp3对HepG2生长的抑制作用较两者单独作用时均强（均P＜0.05）。质粒pmcl-1、pcDNA3.0-vp3及pmcl-1+pcDNA3.0-vp3均可诱导HepG2的凋亡，其中质粒pcDNA3.0-vp3转染24h、48h和72h的凋亡率分别为12.00±1.57％、22.1±2.82％和41.80±3.37％，均高于相应时间pmcl-1组的凋亡率（分别为8.60±0.78％，P=0.03；11.07±0.95％，P=0.03；15.00±1.44％，P=0.00），而pmcl-1联合pcDNA3.0-vp3转染HepG2 24h、48h和72h的凋亡率分别为17.10±1.04％、29.87±4.59％和52.40±1.73％，均较两者单独作用时均高（均P＜0.05）。结论Mcl-1特异性shRNA与凋亡素有协同作用，两者联合可增强对肝癌细胞生长的抑制，增加肝癌细胞的凋亡，是治疗肝癌的有效方法之一。凋亡素诱导的肝癌细胞凋亡与其抑制mcl-1基因，促进线粒体细胞色素C的释放有关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 靶向mcl-1基因的shRNA真核表达质粒的构建与鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 Mcl-1特异性shRNA的筛选及其对肝癌细胞凋亡的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 Mcl-1特异性shRNA联合凋亡素对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文