论文摘要
目的:构建永生化的人骨髓间充质干细胞。方法:采用阳离子脂质体介导法将病毒质粒pBabepuro-hTERT导入包装细胞内,嘌呤霉素（Puro）筛选出病毒表达阳性的细胞克隆,测定病毒滴度。取培养病毒的上清液感hBMSCs细胞、筛选出转基因细胞,我们将其命名为hTERT-hBMSCs细胞。采用端粒酶重复序列扩增（telomere repe at amplification protocol assay ,TRAP）酶链免疫吸附试验（ELISA）法检测hBMSCs细胞转染前后端粒酶活性的变化;采用MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）测绘转染前后细胞生长曲线,观察hTERT转入后对细胞增殖的影响;克隆形成实验检测hTERT-hBMSCs细胞的增殖能力;染色体核型分析观察hTERT-hBMSCs细胞染色体是否正常;成骨试剂盒检测hTERT-hBMSCs细胞向成骨分化的能力。结果:骨髓间充质干细胞为贴壁生长的梭形细胞,表面抗原CD44表达阳性,CD34阴性。TRAP-ELISA法检测转染hTERT的hBMSCs细胞的端粒酶为阳性,而未转录的正常人的hBMSCs细胞则为阴性,说明转入hTERT基因后细胞端粒酶激活。hTERT-hBMSCs细胞比hBMSCs细胞增殖活跃,两组相比有显著的差异性,目前已传了11代,尚未见衰老迹象。染色体核型分析所示:hTERT-hBMSCs细胞染色体数目和结构正常,未见缺失、断裂、异位等畸变。成骨诱导结果表明hTERT-hBMSCs细胞仍具有向成骨分化的能力。克隆形成实验结果显示hTERT-hBMSCs细胞的克隆形成率较低,为0.66%,为正常细胞。结论:导入外源性hTERT可激活细胞端粒酶的活性。hTERT基因转入细胞后,不影响其生物学特性和分化功能,仍然保持向成骨分化的能力。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 端粒酶催化亚基论文; 永生化论文;