5-脂氧酶在PC12细胞缺血性损伤后的激活及其机制

论文摘要

5-脂氧酶（5-lipoxygenase,5-LOX）是催化花生四烯酸生成白三烯类物质的关键酶。在损伤因素作用下,5-LOX可被激活,其激活的重要特征是移位到核膜,继在5-LOX激活蛋白（5-lipoxygenase activating protein,FLAP）等的协同作用下,催化合成白三烯类物质。早期对5-LOX的研究主要集中在呼吸系统等外周疾病。近年来的研究发现,5-LOX在中枢神经系统有广泛分布,并参与中枢神经系统许多疾病的发生,包括脑缺血,脑肿瘤,脑外伤,神经退行性疾病等。脑缺血后,脑内5-LOX表达增加、活性增高,其代谢产物半胱氨酰白三烯（cysteinly leukotrienes,CysLTs）显著增加。5-LOX抑制剂,如AA861、MK886和去甲二氢愈创木酸（nordihydroguaiaretic acid,NDGA）,对实验动物的脑缺血性损伤有保护作用。本实验室的研究也表明,无论是在整体水平还是在离体水平,5-LOX都参与了脑缺血性损伤。其中,在大鼠原代神经元中,缺血性损伤通过激活兴奋性氨基酸NMDA受体,继而激活5-LOX并引起神经元损伤。缺血性损伤过程非常复杂,活性氧（reactive oxygen species,ROS）释放是其中一个主要环节,ROS既是一种细胞损伤因子,也可通过激活p38 MAPK等信号转导分子,诱发炎症反应。缺血损伤是否通过增加ROS释放,进而磷酸化p38,引起5-LOX激活还未见报道。因此,5-LOX在缺血性损伤后的激活机制,除了兴奋性氨基酸途径外是否存在其它途径?尤其对是否存在通过ROS-p38 MAPK的激活途径,仍有待阐明。此外,观察5-LOX核膜移位也需要改进,采用更加直接的方法。本研究在神经来源的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）,首先,以GFP-5-LOX稳定转染PC12细胞;其次,以缺氧缺糖模型（oxygen-glucosedeprivation,OGD）为体外脑缺血性损伤模型,先拟证实5-LOX在缺血性损伤中的作用;然后,观察OGD后是否产生ROS而激活5-LOX,如果上述现象存在,则探讨ROS是否通过磷酸化p38而激活5-LOX。同时,系统评价了5-LOX抑制剂对上述变化的作用方式。第一部分缺血性损伤诱导PC12细胞5-LOX激活为确证5-LOX是否参与OGD诱导的PC12细胞损伤,我们采用GFP-5-LOX转染技术,可视化方法观察5-LOX细胞内分布,并增加5-LOX的蛋白表达,或以反义寡核苷酸降低其表达,同时应用各种5-LOX抑制剂处理,观察OGD/再灌损伤与5-LOX活性的关系。应用荧光显微镜观察OGD/再灌后GFP-5-LOX的核膜移位。结果发现,GFP-5-LOX可稳定地主要表达在细胞核。GFP-5-LOX转染增加5-LOX蛋白的表达可加重OGD/再灌后的细胞损伤,降低5-LOX蛋白的表达可减轻细胞损伤。同时,OGD/再灌可引起时间依赖性5-LOX核膜移位（激活特征之一）,在OGD 2h再灌2h,5-LOX的核膜移位率达到最大（50.5±4.6%）,然后逐渐下降。另一方面,我们发现2h OGD后的再灌过程中5-LOX产物CysLTs释放增加,3h达到高峰,随后逐渐减少,8h时回复到基线水平。所用的抑制剂中,黄芩素、黄芩苷、咖啡酸、NDGA、MK886和齐留通可浓度依赖性减轻OGD/再灌引起的细胞损伤,并显著减少OGD/再灌诱导的CysLTs释放。但是,黄芩素、黄芩苷、咖啡酸和NDGA可浓度依赖性抑制OGD/再灌引起的5-LOX核膜移位;而MK886和齐留通不能抑制5-LOX的核膜移位。以上结果表明,稳定表达的GFP-5-LOX可直观地观察5-LOX核膜移位;OGD/再灌可以激活5-LOX,参与细胞损伤;抑制剂有两种作用类型,即:仅抑制5-LOX酶活性和细胞损伤,同时抑制5-LOX核膜移位、酶活性和细胞损伤。第二部分活性氧参与缺血性损伤诱导PC12细胞5-LOX激活第一部分实验证实OGD/再灌后激活5-LOX,参与细胞损伤。已有研究表明,OGD/再灌后能够产生大量的活性氧（ROS）。因此,我们推测OGD/再灌后产生的ROS可能激活5-LOX。在本实验中,我们首先测定了OGD/再灌后ROS的产生,结果发现OGD 2h再灌0.5h后ROS生成明显增加。黄芩素、黄芩苷、咖啡酸、NDGA和依达拉奉（一种自由基清除剂）能够浓度依赖性的降低OGD 2h再灌0.5h诱导的细胞内ROS的产生;而MK886和齐留通对细胞内ROS的产生没有影响。用外源性H2O2模拟ROS的作用,发现H2O2也可诱导时间和浓度依赖性5-LOX核膜移位,引起细胞损伤。160μM H2O2作用40 min后,5-LOX的核膜移位率达到最大（57.7%±0.8%）。黄芩素、黄芩苷、咖啡酸、NDGA和依达拉奉可浓度依赖性抑制H2O2引起的5-LOX核膜移位,而MK886和齐留通不能抑制核膜移位。此外,黄芩素、黄芩苷、咖啡酸、NDGA、MK886、齐留通和依达拉奉均可浓度依赖的减轻H2O2引起的细胞损伤。结果表明,OGD/再灌后产生的ROS,能够激活5-LOX,参与细胞损伤;黄芩素、黄芩苷、咖啡酸和NDGA同时抑制H2O2引起的5-LOX核膜移位和细胞损伤,而MK886和齐留通抑制细胞损伤。第三部分缺血性损伤通过活性氧激活p38 MAPK而激活5-LOX前两部分结果说明了OGD/再灌后,可通过产生ROS,激活5-LOX,参与细胞损伤。在本部分实验,我们研究了ROS是否通过p38磷酸化激活5-LOX。Western blot结果表明,OGD/再灌可增加p38 MAPK蛋白磷酸化（p38激活）,p38特异性抑制剂SB203580可减轻OGD/再灌引起的5-LOX核膜移位与细胞损伤。用H2O2模拟OGD/再灌后ROS的作用,也能使p38磷酸化,SB203580既可以抑制H2O2引起的5-LOX核膜移位,也可以减轻H2O2引起的细胞损伤。黄芩素、黄芩苷、咖啡酸、NDGA和依达拉奉都能降低OGD/再灌和H2O2引起的p38磷酸化;而MK886和齐留通则无抑制p38磷酸化的作用。结果表明,OGD/再灌可以产生ROS,激活p38,进而激活5-LOX,参与细胞损伤;该过程可被黄芩素、黄芩苷、咖啡酸、NDGA和依达拉奉所抑制,而MK886和齐留通无此作用。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 参考文献
• 第一部分:缺血性损伤诱导PC12细胞5-LOX激活
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第一部分小结
• 参考文献
• 第二部分:活性氧参与缺血性损伤诱导PC12细胞5-LOX激活
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分小结
• 参考文献
• 第三部分:缺血性损伤通过活性氧激活p38 MAPK而激活5-LOX
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三部分小结
• 参考文献
• 结论
• 综述:5-LOX的核膜移位及其调节
• 发表的论文
• 致谢