论文摘要
提高作物品种的氮素利用效率对于改善人类的生存环境、实现农业的可持续发展具有重要作用。植物种属中部分铵转运蛋白在改善植物氮胁迫条件下的氮素吸收和利用效率具有重要作用。本项研究根据GenBank中已经公布的Nippenbare铵转运蛋白OsAMT1；4和OsAMT5序列，设计特异性引物，以氮效率较高的水稻品种TP309DNA为模板，通过PCR技术扩增了上述基因。1、测序结果表明，OsAMT1；4和OsAMT5的cDNA序列在TP309和Nipponbare两品种间没有差异。OsAMT1；4和OsAMT5的编码序列分别长1497bp和1377bp，分别编码498和458个氨基酸残基，均具有11个跨膜域。对OsAMT1；4和OsAMT5进行系统进化分析发现，OsAMT1；4归属于AMT1亚家族，OsAMT5归属于AMT2亚家族。2、利用DNA重组技术，将OsAMT1；4和OsAMT5分别插入到酵母表达载体P426的相应位点，将构建的表达载体转化到NH4+吸收缺陷的酵母突变体31019b中。结果表明，OsAMT1；4和OsAMT5均具有使31019b重新恢复吸收NH4+的能力，表明上述蛋白在水稻中具有吸收或转运NH4+的功能。3、通过半定量RT-PCR方法，分析了OsAMT1；4和OsAMT5的表达特征。结果表明，在供试不同NH4+和NO3-浓度，以及不同NH4+处理时间下，均未检测到OsAMT1；4的表达。OsAMT5仅在叶中特异表达，在根中未检测到转录本，且该基因的表达受高NH4+浓度的诱导。在一定浓度范围内，随着NH4+浓度的增大，OsAMT5被诱导表达水平增高。在NH4+浓度较低的情况下，随处理时间延长，OsAMT5的表达呈不断下降趋势。4、将PCR扩增的OsAMT1；4和OsAMT5与pUCm-T载体连接，转化DH5α后筛选重组子，质粒提取后酶切、连接和转化等DNA重组技术，构建了OsAMT1；4和OsAMT5基因融入植物表达载体pCAMBIA1305的双元基因表达载体pCAMBIA1305-OsAMT1；4和pCAMBIA1305-OsAMT5，转入到农杆菌LBA4404中后获得阳性菌株。通过叶圆片法进行烟草的遗传转化。5、采用PCR技术，克隆了OsAMT1；4启动子可能全长区域和5个不同长度的OsAMT1；4启动子片段，通过将克隆的不同长度启动子片段插入到pCAMBIA1305的相应位置，构建了OsAMT1；4启动子和不同长度片段驱动报告基因GUS表达的植物双元表达载体。将构建的植物表达载体通过热激法转入到根癌农杆菌LBA4404中，利用叶圆片法转化烟草，用潮霉素选择转基因苗的工作正在进行中。本项研究为今后采用进一步研究上述铵转运蛋白基因的功能，以及应用遗传工程技术创建高效吸收利用氮素、具有氮高效特征的作物新种质品种提供了一定的理论依据。
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相关论文文献
- [1].RNAi沉默水稻铵转运体OsAMT1表达的生长效应[J]. 江苏农业学报 2017(06)
标签：水稻论文; 铵转运蛋白论文; 基因功能论文; 基因表达论文; 双元表达载体构建论文;