犬冠状病毒及其受体单克隆抗体的研制与免疫过氧化物酶噬斑染色检测方法的建立

论文摘要

犬冠状病毒（CCV）冠状病毒科,冠状病毒属Ⅰ群冠状病毒,有4种结构蛋白,分别是纤突（S）蛋白,膜（M）蛋白,核（N）蛋白及小膜（SM）蛋白。本研究应用单克隆抗体技术,分别制备了抗CCV单克隆抗体杂交瘤细胞株及抗CCV细胞受体的单克隆抗体杂交瘤细胞株,对CCV一些特性及病毒与细胞受体相互关系进行探讨,并建立了免疫过氧化物酶噬斑染色方法用于CCV感染的血清学诊断。 以纯化的犬冠状病毒（CCV）1-71株免疫BALB/C小鼠,取脾细胞和SP2/0细胞融合,用间接ELISA和中和试验（NT）筛选阳性克隆并用有限稀释法进行亚克隆。用A72细胞包被检测,剔除与细胞蛋白交叉反应阳性的克隆,得到5株杂交瘤细胞株,其中2株是只有ELISA值的单克隆抗体细胞株（E8和H6）,3株既有ELISA值,又有中和性单克隆抗体细胞株（N9、A4和D5）。免疫转印结果显示:E8、H6识别蛋白大小为45kD,100kD及200kD左右。N9,A4和D5识别的蛋白条带分别在45kD,60kD和100kD及200kD左右,间接免疫荧光试验出现绿色荧光。 建立免疫过氧化物酶噬斑（IP）染色技术,用于犬冠状病毒感染诊断。通过中和试验（NT）与间接ELISA检测的阳性和阴性血清系列稀释加入IP检测系统,确定IP检测CCV血清抗体阴阳性临界值为血清40倍稀释,即IP>40为抗体阳性,IP<40为抗体阴性。并利用建立的IP试验对63份犬血清进行了检测。结果显示IP和NT检测健康犬血清20份结果一致,而腹泻犬的43份犬血清中,33份NT抗体阴性,10份阳性,28份IP试验抗体阴性,15份阳性,二者不相符者为5份（15.2%）。显示,IP检测CCV抗体较NT试验敏感。 犬冠状病毒通过和细胞受体结合而感染细胞。用犬纤维瘤细胞（A72）免疫Balb/c小鼠,通过阻断CCV感染细胞试验得到一株单抗R-H-2,免疫转印显示,在分子量为150kD左右有一条明显条带。阻断病毒感染的噬斑染色方法显示CCV1-71和TN 449感染A72细胞噬斑数明显减少,抑制率分别为98.8%和95.65%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 犬冠状病毒研究进展
• 下篇 试验部分
• 第二章 犬冠状病毒单克隆抗体研制
• 1 材料和方法
• 2 单克隆抗体的鉴定
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第三章 免疫过氧化物酶噬斑染色技术检测犬冠状病毒抗体
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四章 阻断CCV感染的细胞受体单抗的研制
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 致谢