淫羊藿苷诱导人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞的实验研究

论文摘要

背景和目的人脐带间充质干细胞的体外分离及定向培养是目前组织工程学的热点。研究淫羊藿苷对人脐带间充质干细胞的生物学作用,以及诱导其向成骨细胞分化的可能。尝试为骨组织工程找到一个新的体外诱导成骨细胞的方案。方法无菌条件下取39-40周健康产妇剖腹产后1 h的脐带（均征得产妇及其家属同意）,去除外膜及血管后,将脐带组织剪碎,接种于培养瓶中。采用贴壁培养法培养并传代。倒置显微镜观察细胞形态及生长情况,免疫细胞化学染色法鉴定细胞表面抗原标志物（CD34,CD44,CD105,CD45）。取生长状态良好的第3代细胞进行细胞爬片,待细胞生长至80%-90%融合时分为2组进行诱导分化,空白对照组加入基础培养基,实验组加入淫羊藿苷和基础培养基诱导培养。倒置显微镜下观察其形态并检测成骨细胞标志物ALP、碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定、钙化结节的检测。将结果进行统计学分析。结果脐带间充质干细胞原代细胞培养4天后,可见组织块周围细胞成放射状生长,类似成纤维细胞,形态均一,贴壁状态。培养15天后,培养瓶有80%-95%融合,按照1：2或者1：3的比率传代,传代后4h细胞贴壁,1-6代细胞12 h贴壁率>85%,24h贴壁率可达90%。6-8d细胞长满瓶底,细胞融合率可达100%。传代细胞在生长的过程中呈现间充质干细胞的形念特点。第3代脐带间充质干细胞免疫组化染色,显示表面标CD44、CD105强阳性,CD34、CD45阴性,检测结果符合人UCMSCs的特征。诱导培养后形态学检测：实验组可见大量脐带间充质干细胞由漩涡状排列向多角形,立方形细胞发展。空白对照组干细胞无明显变化。成骨性检测：随着培养天数的增加,实验组诱导后细胞液中成骨细胞特征性碱性磷酸酶强阳性表达并且有钙沉积。实验组细胞内ALP含量与对照组比较有显著性差异（P<0.001）,实验组钙化结节染色强阳性。结论本实验证明了人脐带中可以提取干细胞并在体外采用组织块贴壁培养法培养,传代,增殖。在一定情况下可以向成骨诱导。在向成骨诱导方面,淫羊藿苷对人脐带间充质干细胞的增殖和成骨分化具有促进作用,可作为骨性诱导因子,在脐带间充质干细胞治疗骨缺损,骨坏死方面有着广阔的前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 前言
• 1 实验材料
• 2 实验准备
• 3 实验方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述 脐带间充质干细胞诱导成骨的研究进展
• 参考文献
• 在读硕士研究生期间发表的论文
• 致谢