ATRA、EGF对人前列腺癌激素非依赖性Du145细胞增殖、凋亡及转移表型的影响

论文摘要

本课题对一种已稳定建株的激素非依赖性前列腺癌细胞Du145分别加入增殖诱导剂EGF和分化诱导剂ATRA前后从细胞水平和分子水平两个层面分别进行研究，探索分化和增殖诱导剂在前列腺癌增殖、转移及凋亡中的作用。为将来采用分化诱导法或凋亡促进法治疗激素非依赖性前列腺癌或预防前列腺癌的转移提供一定的理论基础。 全文分下列三个部分： 第一部分，ATRA、EGF对前列腺癌激素非依赖性细胞株Du145细胞增殖的影响 本部分研究Du145细胞经ATRA、EGF干预后，对细胞生长速率、细胞周期的影响及其相应的分子机理。同时也进一步研究了EGF促进细胞增殖的可能信号通路。结果如下： 1．MTT法检测，ATRA使Du145细胞的生长速率减慢，EGF使Du145细胞的生长速率加快。 2．流式细胞仪检测显示：ATRA主要抑制G1期细胞向S期转换而抑制细胞增殖，使G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少，而EGF的作用相反。 3．ATRA组细胞、EGF组细胞与对照组细胞相比，细胞周期蛋白（cyclin）D1、A和E及周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK2，CDK4的蛋白表达均无明显变化；周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂（CKI）中p16，p21的表达也无明显区别， 4．ATRA可促进p27的表达，与cyclinA／E-CDK2复合物相结合的p27的量也明显上升，但p27的mRNA水平却无明显变化。EGF可抑制p27的表达，与cyclinA／E-CDK2复合物相结合的p27的量也明显下降，但p27的mRNA水平也无明显变化。 5．ATRA处理组细胞与对照组细胞相比，磷酸化的Rb下调，非磷酸化的Rb相应增多。EGF处理组细胞与对照组细胞相比，磷酸化的Rb上调，非磷酸化的Rb相应减少。 6．PI-3K抑制剂LY294002不能消除EGF组细胞中p27的表达及Rb的磷酸化水平的差别，而MEK磷酸化的抑制剂PD98059则能消除这些差别，表明EGF由MEK-MAPK信号通路而非PI-3K-PKB通路调节p27的表达。 本部分研究结果可以认为：ATRA主要通过促进p27的表达，使其对CDK2的抑制加强，引起CDK2活力减弱。抑制了Rb磷酸化及其DNA合成，从而使细胞停留在G1期。EGF主要通过抑制p27的表达，使其对CDK2的抑制减弱，引起CDK2活力增加。活化的CDK2又使Rb磷酸化，最后磷酸化的Rb脱离与之结合的转录因子E2F，使后者转移至核内，促进DNA合成，从而使细胞由G1期通过限制点而向S期转化。EGF促进细胞增殖的作用主要通过MEK／MAPK信号通路向细胞内传导。 第二部分 ATRA、EGF对前列腺癌激素非依赖性细胞株Du145细胞凋亡的影响 本部分研究Du145细胞经ATRA、EGF干预后，ATRA、EGF调控Du145细胞凋亡的分子机制，进一步研究了ATRA、EGF对Du145细胞骨架蛋白F-actin的影响。结果如下： 1．流式细胞仪检测发现Du145细胞对40μM ATRA处理48h后，凋亡比例明显升高，表现为凋亡细胞峰（亚二倍体峰）的明显出现及升高，而用EGF处理组没有明显的凋亡峰。 2．AO染色后免疫荧光显微镜观察显示：ATRA处理组可出现明显的凋亡小体。 3．磷酸化PKB-T308和Bad-S136的表达都是ATRA＜Control＜EGF组细胞。 4．在ATRA作用下，Du145细胞中促凋亡的Bax增高，并且ATRA组＞Control＞EGF组细胞，而抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xL则下调，其变化趋势与Bax相反。 5．EGF、ATRA处理Du145细胞中的p53，死亡受体凋亡通路中的Fas-L，Fas的表达均无明显改变。 6．经ATRA处理后，Du145细胞中被裂解后有活性的caspase-3片段显著增多；EGF处理时，caspase-3的裂解产物极少，主要以无活性的酶原形式存在。 7．EGF组细胞中，细胞骨架蛋白—肌动蛋白F-actin表现为排列较为整齐，清晰，边缘完整。Du145细胞在ATRA作用下，F-actin的正常的结构被破坏呈稀疏、不规则、发散状排列，并且边缘呈破损状。 从本部分的结果看来，ATRA作为一个凋亡诱导因子，主要通过抑制一些抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL）及PKB的活性，和促进一些促凋亡蛋白（Bax、Bad）的表达。这些ATRA引起的抗凋亡蛋白的表达下调和促凋亡蛋白的表达增加活化了caspase-3，引起细胞结构的变化，推断ATRA可能主要通过线粒体途径由caspase-3途径介导，并导致细胞骨架的破坏从而诱导的Du145细胞的凋亡。而EGF的作用相反，抑制了细胞的凋亡。第三部分 ATRA、EGF对前列腺癌激素非依赖性细胞株Du145细胞转移表型的影响 本部分研究Du145细胞经EGF，ATRA干预后，ATRA、EGF对Du145细胞转移表型的影响及相关的分子机制，结果如下： 1．ATRA可抑制Du145细胞对Fn的黏附能力；EGF可促进Du145细胞对纤连蛋白（Fn）的黏附能力。 2．ATRA可抑制Du145细胞对HUVEC的黏附能力；EGF可促进Du145细胞对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的黏附能力。 3．ATRA可抑制Du145细胞的迁移和侵袭能力；EGF可促进Du145细胞的迁移力（Transwell法和划痕法）。 4．ATRA可抑制Du145细胞的侵袭能力；EGF可促进Du145细胞的侵袭能力（Transwell法）。 5．EGF处理使Du145细胞中整联蛋白α5β1中β1亚基蛋白的表达显著增加（western blot、流式细胞检测法），MAPK信号通路抑制剂PD98059可使Du145细胞中整联蛋白α5β1中β1亚基蛋白的表达下调。 6．EGF处理使Du145细胞中整联蛋白α5β1中β1亚基mRNA的表达上调；MAPK信号通路抑制剂PD98059可使Du145细胞中整联蛋白α5β1中β1亚基mRNA的表达下调；（RT-PCR检测）。 从本部分的结果看来，ATRA处理使Du145细胞粘附和迁移、侵袭能力增明显降低，而EGF能促进Du145对Fn、HUVEC的粘附能力和迁移、侵袭能力。Fn的主要受体是整联蛋白α5β1，我们进一步研究EGF的MAPK信号通路对Du145细胞中整联蛋白α5和β1表达的影响。细胞经EGF及其EGF+MAPK信号通路抑制剂PD98059分别处理，流式细胞仪检测及Western-blot检测显示整联蛋白α5的表达没有发生明显改变，但EGF处理使整联蛋白α5β1中β1亚基蛋白的表达显著增加而EGF+MAPK信号通路抑制剂PD98059后可使Du145细胞中整联蛋白α5β1中β1亚基蛋白的表达下调。RT-PCR检测结果这种调控作用主要发生在mRNA水平上，并且这种变化与细胞对Fn的粘附和迁移能力变化的消长相一致。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 ATRA、EGF对前列腺癌激素非依赖性Du145细胞增殖的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 ATRA、EGF对前列腺癌激素非依赖性Du145细胞凋亡的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 ATRA、EGF对前列腺癌激素非依赖性Du145细胞转移表型的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文小结
• 创新点及其意义
• 今后方向
• 综述1 前列腺癌转移机制的研究现状与进展
• 综述2 分化诱导剂维甲酸（RA）在肿瘤治疗方面的研究进展
• 致谢
• 附录1
• 附录2