论文摘要
谷胱甘肽过氧化酶（Glutathione peroxidase,GPx）是机体内重要的抗氧化蛋白酶,它能清除过量的氢过氧化物以保持机体内活性氧（ROS）代谢平衡,从而保护机体免遭氧化损伤。因此,GPx作为抗氧化剂具有巨大的药用价值。但天然GPx异源表达困难、酶水解以及半衰期短等缺点限制了它的生物医学应用,因而设计合成高效GPx抗氧化酶模拟物受到学术界广泛关注。GPx的催化基团是被称为第21种氨基酸的硒代半胱氨酸（SeCys）,其三联体密码子为终止密码子UGA,故很难利用传统的基因工程方法表达。因此本论文采用大肠杆菌半胱氨酸营养缺陷型表达体系,从GPx的本质出发,在充分考虑底物结合和分子内催化这两个重要因素的基础上,设计并制备针对不同底物的催化位点明确的高效GPx模拟物。1.构建碲代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx谷胱甘肽硫转移酶（GST）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）同属于硫氧还蛋白超家族,两者对于共同底物谷胱甘肽（GSH）的结合部位结构基本相同,且催化中心的相对位置相似。与GPx的催化中心硒代半胱氨酸（SeCys）相比,碲代半胱氨酸（TeCys）的氧化还原电势更低:TeCys（-850mV versus Ag/AgCl） vs.SeCys （-640 mV versus Ag/AgCl）。因此,含有TeCys残基的蛋白质必将具有更加优异的氧化还原性能,从而更好的发挥生物学功能。为此,我们以Lucilia cuprina GST为骨架,利用其天然存在的GSH结合部位,采用大肠杆菌半胱氨酸营养缺陷型表达体系首次将催化基团TeCys引入活性中心,获得首例利用基因工程法制备的含碲GPx模拟酶,该含碲酶显示出极高的催化活性,其以GSH为底物的GPx活力可与天然酶相媲美。含碲模拟酶的催化机制为顺序机制,很多酶学性质同天然GPx近似。它的成功还为GPx与GST在进化上具有共同祖先这一假说提供了证据,同时又一次证明了新酶活力进化的主导因素是化学选择性而不是结合专一性。这种普适的含碲GPx模拟物制备方法可以被推广到更多蛋白模型中,从而为研究蛋白质中碲化学以及结构与功能之间关系提供强有力的手段,同时作为抗氧化药物具有一定的应用前景。2.构建硒代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx谷胱甘肽硫转移酶（GST）可催化GSH的亲电芳环取代反应,其中最具代表性的便是催化GSH与1-氯-2,4二硝基苯（CDNB）的反应。GST除了具有GSH特异性结合部位（G-site）,还具有与其比邻的可结合另一底物的H-Site。考虑到CDNB同3-羧基-4-硝基苯硫酚（CNBSH）结构上的相似性,以GST中对于CDNB有非特异性识别的H-Site为识别部位构筑硒酶GPx催化中心。采用大肠杆菌半胱氨酸营养缺陷型表达体系成功将催化基团SeCys引入到H-Site适当位置。通过尿素梯度葡聚糖凝胶柱方法对包涵体复性,得到含硒GPx模拟酶。该酶具有以CNBSH为底物的GPx活力,且对多种过氧化物都显示出催化效率,其中对枯烯过氧化氢（CUOOH）表现出最高活力。稳态动力学表明其催化机制可能为顺序机制。实验再次证实,底物结合及其与酶的催化官能团在空间上的正确定位对获得高效模拟酶至关重要。
论文目录
提要第一章 文献综述第一节 谷胱甘肽过氧化物酶1. GPx 的分类1.1 细胞内GPx （cGPx）1.2 胃肠道GPx （giGPx）1.3 血浆GPx （pGPx）1.4 磷脂氢GPx （PHGPx）2. GPx 的结构2.1 牛cGPx 的结构2.2 人pGPx 的活性中心结构3. GPx 的催化机制3.1 乒乓机制3.2 顺序机制4. GPx 的人工模拟4.1 小分子GPx 模拟物4.2 生物大分子GPx 模拟物第二节 谷胱甘肽硫转移酶1. GST 的分类2. GST 的结构3. GST 的进化第三节 硒蛋白的表达1. Escherichia coli 的SeCys 插入机制表达硒蛋白1.1 硒代半胱氨酸的生物合成及掺入1.2 SeCys 插入机制制备硒蛋白的现状2. Escherichia coli 半胱氨酸营养缺陷型表达硒蛋白2.1 营养缺陷型表达体系的来源2.2 营养缺陷型表达体系的发展2.3 利用大肠杆菌半胱氨酸营养缺陷型表达硒蛋白参考文献第二章 本文立论依据1. 构建碲代谷胱甘肽硫转移酶模拟 GPx2. 构建硒代谷胱甘肽硫转移酶模拟 GPx参考文献第三章 构建碲代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx第一节 序言第二节 碲代谷胱甘肽硫转移酶的表达载体一、实验材料1.1 主要试剂1.2 菌株和质粒1.3 实验仪器1.4 培养基和主要溶液的配制二、实验方法2.1 质粒的提取2.2 琼脂糖（Agarose）凝胶电泳2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（以下均需无菌操作）2.4 质粒的转化三、结果分析第三节 半胱氨酸营养缺陷型体系表达碲代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx 的可行性分析一、实验材料1.1 主要试剂1.2 实验仪器二、实验方法2.1 碲代半胱氨酸氧化还原电势的测定2.2 GSH 对碲代胱氨酸还原能力的判定2.3 碲代半胱氨酸同E. coli tRNACys 的氨酰化反应三、结果分析3.1 碲代半胱氨酸的氧化还原电势3.2 GSH 对碲代胱氨酸的还原能力3.3 碲代半胱氨酸同E. coli tRNACys 的氨酰化反应四、讨论第四节 碲代谷胱甘肽硫转移酶、野生型谷胱甘肽硫转移酶及其突变体的表达、分离提纯及表征一、实验材料1.1 主要试剂1.2 实验仪器1.3 主要溶液的配制二、实验方法2.1 野生型LuGST1-1 及其突变体的表达2.2 Telluro-LuGST1-1 的表达2.3 Seleno-LuGST1-1 的诱导表达2.4 LuGST1-1 及其突变体、telluro-LuGST1、seleno-LuGST1-1的纯化2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2.6 蛋白质含量测定2.7 质谱鉴定2.8 碲含量的测定三、结果分析3.1 野生型LuGST1-1 及其突变体的表达3.2 Telluro-LuGST1-1 的表达3.3 Telluro-LuGST1-1 的分离提纯3.4 Telluro-LuGST1-1 的质谱鉴定3.5 Telluro-LuGST1-1 碲含量的测定四、讨论第五节 碲代谷胱甘肽硫转移酶的酶学性质分析一、实验材料1.1 主要试剂1.2 实验仪器二、实验方法2.1 活力的测定2.2 蛋白质含量测定2.3 温度和pH 值对模拟酶GPx 活性影响的测定2.4 Telluro-LuGST1-1 的稳定性三、 结果分析3.1 Telluro-LuGST1-1 的GPx 与GST 活力3.2 最适pH 值和最适温度3.3 Telluro-LuGST1-1 的稳定性四、讨论第六节 碲代谷胱甘肽硫转移酶的动力学研究一、实验材料1.1 主要试剂1.2 实验仪器二、实验方法2.1 蛋白质含量测定2.2 稳态动力学性质研究三、结果分析四、讨论本章小结参考文献第四章 构建硒代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx第一节 序言第二节 酶和底物相互作用的计算机模拟一、实验方法二、结果与讨论第三节 硒代谷胱甘肽硫转移酶表达载体的构建一、实验材料1.1 主要试剂1.2 菌株和质粒1.3 主要仪器二、实验方法2.1 目的基因Y113C 的定点突变2.2 目的基因C9S 的定点突变三、结果与讨论3.1 关于Y113C 和C9S 的设计3.2 快速一步定点突变方法及原理第四节 硒代谷胱甘肽硫转移酶的表达纯化一、实验材料1.1 主要试剂1.2 实验仪器1.3 主要溶液的配制二、实验方法2.1 野生型LuGST1-1 及其突变体的表达2.2 Seleno-LuGST1-1 的诱导表达2.3 LuGST1-1 及其突变体、seleno-LuGST1-1 的分离纯化..2.4 蛋白质含量测定2.5 圆二色谱分析三、结果分析3.1 野生型LuGST1-1 及其突变体的表达3.2 Seleno-LuGST1-1 的诱导表达3.3 Seleno-LuGST1-1 的分离纯化3.4 蛋白质的圆二色谱分析四、讨论第五节 硒代谷胱甘肽硫转移酶的酶学性质一、实验材料1.1 主要试剂1.2 实验仪器二、实验方法2.1 以CNBSH 为底物的GPx 活力的测定2.2 蛋白质含量测定2.3 温度和pH 值对模拟酶GPx 活性影响的测定2.4 稳态动力学性质研究三、 结果分析3.1 Seleno-LuGST1-1 以CDNSH 为底物的GPx 活力3.2 最适pH 值和最适温度3.3 稳态动力学性质四、讨论本章小结参考文献结论作者简历博士期间发表的论文致谢中文摘要ABSTRACT
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- [1].SIRT1与动脉粥样硬化相关性研究进展[J]. 中华临床医师杂志(电子版) 2013(08)
标签：谷胱甘肽过氧化物酶论文; 碲代半胱氨酸论文; 酶的再设计论文;
